Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Summary

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Abstract

Floëem en plant sap voeding insecten invasie van de integriteit van gewassen en vruchten te halen voedingsstoffen, in het proces schadelijk voor voeding bestemde gewassen. Hemipteran insecten account voor een aantal economisch grote plagen van planten die leiden schade aan gewassen tot door het eten van floëem sap. De bruine marmorated hilare (BMSB), Halyomorpha Kizil Irmak (Wantsen: Schildwantsen) en de Aziatische citrus psyllid (ACS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) zijn hemipteran insectenplagen geïntroduceerd in Noord-Amerika, waar ze zijn een invasieve landbouw plaag voor hoogwaardige specialiteit, rij, en stapelvezels gewassen en citrusvruchten, evenals een overlast plaag wanneer ze binnenshuis aggregaat. Insecticide resistentie in vele soorten heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden van pest managementstrategieën. Double-stranded RNA (dsRNA)-gemedieerde RNA-interferentie (RNAi) is een gen silencing mechanisme voor functioneel genomisch studies met mogelijke toepassingen als een instrument voor het beheer van insectenplagen. Exogenously gesynthetiseerde dsRNA of Klein Mengend RNA (siRNA) kan leiden tot zeer efficiënte gene zwijgen door de afbraak van endogene RNA, dat homoloog aan die gepresenteerd. Effectieve en ecologische gebruik van RNAi als moleculaire biopesticides voor biocontrol van hemipteran insecten vereist de in vivo levering van dsRNAs via voeding. Hier tonen we methoden voor levering van dsRNA aan insecten: laden van dsRNA in groene bonen door onderdompeling en absorberen van gen-specifieke dsRNA met mondelinge bezorging via ingestie. We hebben ook niet-transgene plant levering benaderingen met behulp van naalden sprays, wortel kletsnat, kofferbak injecties evenals kleikorrels, die allemaal essentieel voor duurzame release van dsRNA kan worden geschetst. Efficiënte levering door oraal ingenomen dsRNA werd bevestigd als een effectieve dosering voor het opwekken van een aanzienlijke afname van de expressie van gerichte genen, zoals juvenile hormoon acid-O-methyltransferase (JHAMT) en vitellogenin (Vg). Deze innovatieve methoden vertegenwoordigen strategieën voor levering van dsRNA gebruiken in gewasbescherming en overwinnen van de uitdagingen op milieugebied voor gewasbescherming.

Introduction

Hemipteran insecten omvatten enkele van de meest economisch belangrijke plagen van agriculturebecause van hun vermogen om te bereiken van verhoogde bevolkingsgroei en ziektes bij planten verspreiden. De BMSB, H. Kizil Irmak Stål, is een invasieve plaag die per ongeluk werd geïntroduceerd in het westelijk halfrond in Allentown, Pennsylvania uit Azië (China, Taiwan, Korea en Japan) met de eerste waarneming in 1996¹gemeld. Sinds de invoering ervan, BMSB is geconstateerd in 43 landen met de hoogste populaties in de Mid-Atlantische (DE, MD, PA, NJ, VA, en WV), alsook in Canada en Europa, en vormt een potentiële bedreiging voor de landbouw². Als een polyfage plaag, kunnen BMSB teweeg brengen schade aan ongeveer 300 geïdentificeerde plant gastheren met inbegrip van hoogwaardige gewassen zoals appels, druiven, sierplanten, zaadgewassen, sojabonen en maïs. Schade veroorzaakt vooral vanwege de wijze van het voeden lacerate en flush genoemd waar het dier doorboort het gewas van de host met de naald-achtige stilet toegang te krijgen tot de voedingsstoffen uit de vaatbundels weefsels^2,3. BMSB is ook een overdekt ongedierte zoals zij woonplaats in woonruimtes zoals scholen vinden kunnen en huizen tijdens herfst en winter². Chemische stoffen en aeroallergens uitgebracht door BMSB werden gemeld aan illegale allergische reactie in fruit gewas werknemers. BMSB kunnen ook bijdragen tot de allergische ziekte leiden tot conjunctivitis, contactdermatitis en rhinitis in gevoelige personen^4,5. Een ander hemipteran insect, de ACS, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), is een ernstige plaag van citrusvruchten, en stuurt het floëem-beperkte-bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) veroorzaken Huanglongbing (HLB), beter bekend als zoals citrus vergroening ziekte^6,7. HLB werd voor het eerst gemeld uit Zuid-China en heeft zich verspreid naar 40 verschillende Aziatische, Afrikaanse, Oceanië, Zuid- en Noord-Amerikaanse landen⁷. Citrus “vergroening” is een wereldwijd probleem met het bedreigen van de economische en financiële verliezen als gevolg van verlies van citrusvruchten; Vandaar, beheer van ACS-landen wordt overwogen van het grootste belang ter voorkoming en bestrijding van HLB.

Maatregelen voor doeltreffende controle op deze insectenplagen gewoonlijk vereist de toepassing van chemische bestrijdingsmiddelen die relatief kort zijn geleefd. Chemische insecticide bestrijdingsstrategieën vaak gebrek aan veilige milieumanagement strategieën of gevoeligheid als gevolg van bestrijdingsmiddelen weerstand in^8,9van de populaties van de pest is afgenomen. Vandaar, de biologische bestrijding van plagen met moleculaire biopesticides is een mogelijke alternatief, maar het gebruik ervan blijft wereldwijd bescheiden, en verschillende soorten parasitoïden (b.v. Trisolcus japonicus) kunnen ook gelden als natuurlijke biologische besturingselementen. RNAi is een potentieel opkomende technologie voor het beheer van invasieve insectenplagen met moleculaire biopesticides¹⁰. RNAi is een goed beschreven gene regelgevende mechanisme dat de effectieve posttranscriptional gen tot zwijgen brengen van endogene vergemakkelijkt evenals de invasie van dsRNAs in een reeks specifieke wijze, die uiteindelijk tot de regulering van de expressie van genen op het mRNA leidt niveau^11,12. Kort, wanneer exogene dsRNA is geïnternaliseerd in een cel die het tot siRNAs wordt verwerkt door een lid van de superfamilie van de RNase III bidentate nuclease, Dicer, die is evolutionair bewaard in wormen, vliegen, planten, schimmels en zoogdieren^13, genoemd ^{14 , 15}. deze 21-25 nucleotide siRNA duplexen vervolgens worden afgewikkeld en geïntegreerd in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) RNAs begeleiden. Dit complex RISC-RNA kan Watson-Crick basis koppeling naar de complementaire doelgroep mRNA; Dit leidt uiteindelijk tot splitsing door de Argonaute proteïne, een multi-domein eiwit met een RNase H-achtige domein, die degradeert de bijbehorende mRNA en vermindert eiwit vertaling, waardoor posttranscriptional gene silencing^{16 , 17 , 18}.

RNAi voor gewasbescherming vereist de invoering van dsRNA in vivo te zwijgen van het gen van belang, waardoor het activeren van de siRNA pathway. Verschillende methoden die zijn gebruikt voor dsRNA levering aan insecten en insecten cellen voor het opwekken van systemische RNAi omvatten voeding^10,19, inweken van^20,21, microinjection²², vervoerders zoals liposomen ²³, en andere technieken²⁴. RNAi was eerste aangetoond in Caenorhabditis elegans unc-22 genexpressie door brand zwijgen op te leggen en Mello²⁵, gevolgd door knockdown in expressie van de Gekroesde genen bij Drosophila melanogaster²⁶. Eerste functionele studies gebruikt microinjection dsRNA om in te leveren insecten, zoals Apis mellifera^22,27, Acyrthosiphon pisum²⁸, Blattella germanica²⁹, H. Kizil Irmak³⁰en Lepidoptera insecten (herzien door Terenius et al. ³¹). microinjection is voordelig voor het leveren van een nauwkeurige en precieze dosis op de site van belangstelling voor het insect. Zij dergelijke septische lekke banden expressie van immuun verwante genen als gevolg van trauma³², vandaar uitlokken kunnen, uitgesloten zijn bruikbaarheid in de ontwikkeling van de agrarische biopesticides.

Een andere methode van het leveren van dsRNA in vivo is door inweken, waarbij inname of absorptie van dsRNA door schorsing van dieren of cellen in het algemeen in extracellulaire opslagmedium met dsRNA. Soaking is gebruikt voor het efficiënt opwekken van RNAi in Drosophila S2 weefselkweek cellen voor de remming van Downstream-van-Raf1 (DSOR1) mitogeen-geactiveerd proteïne kinase kinase (MAPKK)²⁰, evenals in C. elegans om te zwijgen van de POS-1 gene³³. DsRNA geleverd met inweken is echter minder efficiënt voor het opwekken van RNAi ten opzichte van microinjection²⁰. RNAi gemedieerde monddood maken in een kauwen insect werd het eerst getoond in de westerse maïswortelboorder (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) door de dsRNA infusie in een kunstmatige agar dieet¹⁰. Eerdere rapporten hebben methoden om te leveren dsRNA toegediend in natuurlijke diëten specifiek voor geleedpotigen³⁴samengevat. Deze methoden voor het afleveren wilden verder relatief effectief naar kunstmatige vormen van levering; zoals het geval van de tseetseevlieg (Glossina morsitans morsitans), waar gelijke knockdown van een immuun-gerelateerde gen werd waargenomen wanneer dsRNA werd geleverd via bloedmeel of microinjected³⁵. Ook levering van dsRNA via druppels in licht bruin apple nachtvlinder (Epiphyas postvittana)³⁶,³⁷larven Koolmot (Plutella xylostella), evenals honing bijen^38,39 geïnduceerde efficiënte RNAi. Meest effectieve RNAi experimenten in hemipteran hebben injectie van dsRNA⁴⁰ gebruikt omdat mondelinge levering van dsRNA in hemipteran insecten lastig is omdat het moet worden geleverd door middel van de waardplant vascular weefsels. Effectieve RNAi werd ook waargenomen in de ACS-landen en glazig-gevleugelde scherpschutter dwergcicade (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA werd geleverd door middel van citrus en wijnstokken die had dsRNA geabsorbeerd in de vaatbundels weefsels via root kletsnat, naalden sprays, kofferbak injecties of absorptie door stekken^{41,42,43,44,45,46}. Dit resulteerde ook in het eerste octrooi voor dsRNA tegen de ACS (2016, ons 20170211082 A1). Levering van siRNA en dsRNA gebruikend dragers zoals nanodeeltjes en liposomen zorgt voor stabiliteit en stijgingen van de geleverde dsRNA werkzaamheid zijn snel opkomende^{23,47,48,49 ,},⁵⁰. Een nieuwe klasse van nanoparticle gebaseerde leverende voertuigen voor nucleïnezuren voor in vitro en in vivo die specifiek voor therapeutische toepassingen immense potentieel geven kunnen als geschikte levering^{51 vectoren}werd samengevat. Nanodeeltjes als een leveringsvoertuig voor dsRNA kan hebben nadelen zoals oplosbaarheid, hydrophobicity of beperkte bioaccumulatie⁵², maar een geschikt polymeer hulp levering deze nadelen kan compenseren. Ontwikkeling en het gebruik van het zelf leveren nucleotiden zijn ook genaamd ‘antisense oligonucleotides’, die één gestrande RNA/DNA duplexen⁴⁶in opkomst.

Vitellogenesis bij geleedpotigen is een sleutel proces beheersing van de voortplanting en gereglementeerd door juvenile hormoon (JH) of ecdysone, welke zijn de belangrijkste inductoren van Vg synthese door het lichaamsvet; de Vg is uiteindelijk opgepikt door de ontwikkelingslanden oöcyt via Vg receptor gemedieerde endocytose⁵³. VG is een groep polypeptiden gesynthetiseerd extraovarially, die essentieel is voor de ontwikkeling van het grote ei eidooier eiwit, vitellin^54,55, en daarom is het belangrijk in de reproductie en veroudering⁵⁶. VG heeft met succes in nematoden⁵⁷ is het zwijgen opgelegd, alsmede in de honingbij (Apis mellifera) waar RNAi uitputting van Vg gemedieerde werd waargenomen in volwassenen en eieren²². RNAi gemedieerde posttranscriptional gen tot zwijgen brengen van Vg was getest omdat men dacht dat de uitputting zou leiden tot een waarneembare fenotypische effect zoals verminderde vruchtbaarheid en vruchtbaarheid, om te kunnen helpen bij het BMSB controle. De JHAMT-gen dat codeert voor de S-adenosyl-L-methionine (SAM)-afhankelijke JH zure O-methyltransferase, katalyseert de laatste stap van de JH biosynthese pathway⁵⁸. In dit traject farnesyl pyrofosfaat (FPP) opeenvolgend van farnesol, omgevormd naar farnesoic zuur, gevolgd door conversie van methyl farnesoate naar JH door JHAMT. Dit traject is geconserveerd in insecten en andere geleedpotigen specifiek voor de metamorfose, een proces dat ontwikkelingsachterstand wordt gereguleerd door hormonen^59,60,^,61. In B. morisuggereren JHAMT genexpressie en de JH biosynthetic activiteit in de Corpora allata dat er sprake is van cruciaal belang voor de beëindiging van JH biosynthese⁵⁸de transcriptionele onderdrukking van het JHAMT -gen. Daarom werden de genen JHAMT en Vg geselecteerd voor gerichte uitputting met behulp van RNAi. RNAi werd ook getest in citrusbomen voor controle van de ACS-landen en GWSS. Citrusbomen werden behandeld met dsRNA via root kletsnat, stammen van de kraan (trunk injecties), evenals naalden sprays met dsRNAs tegen insecten specifieke arginine kinase (AK) afschriften^42,44. De actuele toepassing van dsRNA werd ontdekt over het bladerdak van citrusbomen, met vermelding van efficiënte levering via de planten vascular weefsels, en heeft geleid tot verhoogde sterfte in ACS-landen en GWSS^{41,42, 45}.

In de huidige studie, hebben we een methode voor het bezorgen van natuurlijke dieet voor behandelingen zoals dsRNA vastgesteld. Deze nieuw ontwikkelde techniek werd later gebruikt voor de JHAMT en Vg silencing mRNA met behulp van gen-specifieke dsRNAs in BMSB nimfen als aangetoond eerder⁶². Deze nieuwe levering protocollen hier gedemonstreerd vervangt conventionele RNA levering systemen die gebruik maken van actuele sprays of microinjections. Groenten en fruit, stam kraan, bodem drenken en klei sorbents in kunnen worden gebruikt voor de levering van dsRNA, die is cruciaal voor de verdere ontwikkeling van biopesticide beheer op het gebied van ongediertebestrijding en pathogenen.

Protocol

1. BMSB fokken Achterzijde BMSB insecten per standaard lab praktijk en eerder beschreven63. ACS (D. citri) insecten op Citrus macrophylla in een kas (22 ° C) en het natuurlijke licht te verhogen. Gebruik van volwassen ACS, op ongeveer 5-7 dagen post eclosion. 2. selectie van Gene regio’s en In Vitro synthese van dsRNA Selecteer specifieke genen aan BMSB van eerder gepubliceerde transcriptome profielen<sup c…

Representative Results

Plantaardige gemedieerde dsRNA levering via voeding in BMSB 4th instar nimfen werd getest voor de ontwikkeling van moleculaire biopesticides met behulp van RNAi voor invasieve insectenplagen. BMSBs feed via hun naald-achtige stylets door een mechanisme bekend als lacerate en leegmaken, waardoor aanzienlijke schade aan gewassen. Slanke biologische sperziebonen, P. vulgaris L., werden gebruikt om te testen of nutriënten of dsRNA kon worden verstuurd in vivo naa…

Discussion

RNAi heeft bewezen te zijn een belangrijk instrument voor het verkennen van biologische genfunctie en regelgeving, met een groot potentieel om te worden gebruikt voor beheer van insectenplagen^{19,68,69,70, 71}. het ontwerp en de selectie van een geschikte gene(s) voor silencing in een bepaald insect soorten en de methode van levering van de bijbehorende dsRNA(s…

Materials

BMSB (H. halys) insects	USDA
ACP (D. citri) insects	USDA
organic green beans	N/A
Citrus plants	USDA
sodium hypochlorite solution	J.T. Baker
green food coloring	McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers	Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture)	Sigma
Primers	IDT DNA
SensiMix SYBR	Bioline
qPCR ABI 7500	Applied Biosystems
Spray bottle	N/A
Parafilm	American Can Company
TaKaRa Ex Taq	Clontech
QIAquick	Qiagen