JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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면역학 및 감염병학

蛋白質のマイクロ アレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム ・ ディフィシル感染症の血清学的定量

Published: June 15, 2018
doi:
10.3791/57399
, ,
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen’s Medical Centre,University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine,Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen’s Medical Centre,University of Nottingham

Summary

この記事では、ひと血清中におけるクロストリジウム ・ ディフィシル抗原を精製の 7 プレックス パネルに対する体液性免疫応答の高プロファイルの単純なタンパク質マイクロ アレイ法について説明します。特定抗体ポリクローナル免疫グロブリン製剤の定量プロトコルを拡張することができます。

Abstract

クロストリジウム ・ ディフィシル抗体ポリクローナルの静脈内の免疫グロブリン (IVIg) の別の準備、ひと血清中で反による高スループット蛋白質マイクロ アレイ分析の詳細な概要をいたします。プロトコルでは、サンプル作製、印刷配列、試金プロシージャ、およびデータ分析の方法論的手順について説明します。さらに、このプロトコルは、プラズマを含む多様な臨床サンプルを取り込んで細胞培養上清にさらに開発できます。蛋白質のマイクロ アレイを使用して、アイソタイプ (IgG、IgA、IgM), サブクラス (IgG1、IgG2, IgG3, IgG4、IgA1、iga2 は) の組み合わせを決定する方法を示す、株特異抗体高純度全体c. ディフィシル毒素 A と B (toxinotype 0、ひずみ VPI10463、ribotype 087) 毒素 B、 c. ディフィシル毒素 B だけ表現するひずみ (CCUG 20309) から、バイナリ毒素、pCDTb、ribotype 全体の表層抗原 B フラグメントの前駆体フォーム (Slp; 001、002、027)、制御タンパク質 (破傷風、トキソイドとカンジダ)。血清c. ディフィシル感染症 (CDI)、健常者 (HC)、下痢症嚢胞性線維症 (CF) を持つ個人に個人個人の事前のポスト IVIg 療法からもプローブ、マイクロ アレイ実験中に、CDI、複合型免疫不全疾患、慢性炎症性脱髄性 polyradiculopathy の治療。我々 は、IVIg と前に血清の商業準備の患者グループと次の IVIg 投与間毒素の中和効果とマルチ アイソタイプ特異抗体レベル差が発生します。また、あるマイクロ アレイと酵素免疫測定法 (ELISA) 相関抗毒素 igg の血清中。そのマイクロ アレイがC.difficileワクチン接種や感染したヒトの抗原抗体反応をプロファイリングするための有望なツールになる可能性が示唆されました。さらに洗練された抗原パネルの生産コストの削減、最適化し、患者固有の方法でc. ディフィシル感染症の最も臨床的に有用な免疫療法を選択マイクロ アレイ技術が役立つことを期待しています。

Introduction

このプロトコルでは、開発、検出のための新規およびカスタマイズされたタンパク質マイクロ アレイ アッセイの検証と菌株のアイソタイプ特異抗体のc. ディフィシル抗原半定量をについて説明します。我々 は正常に私たちのdifficile C.を使用して-患者血清1、2IVIg3の準備で特異抗体コンテンツの組成の生化学分析のための有望な新しいツールとして特定のマイクロ アレイ分析とCDI4の転帰不良と相関する抗体の特異性の id。Difficile C.病原体特異抗体のこのアッセイでの質の高い再現性のあるプロファイリングできるように biobanked 血清と市販の IVIg をマイクロ アレイ スライドに分析する方法を紹介します。

多くの健康な子供および大人検出血清 IgG, IgA 抗体c. ディフィシル毒素 A と B5,6があります。これらは幼児期と成人期のdifficile C.への暴露を次時に一時的な露出の後で発生すると考えられています。このため、ポリクローナル IVIg がずっと再発と劇症 CDI7,8,9を治療するためにオフにラベルを使用します。しかし、その決定的な役割と作用は不明のまま。いくつかの研究は、 C. difficile毒素に体液性免疫反応が病気の発表や結果に役割を果たすことを示しています。具体的には、無症候性の患者は、増加血清抗毒素 A IgG 濃度10症候性疾患を発症した患者と比較して表示します。明白な協会中央抗毒素 A IgG 抗体と 30 日間全ての原因の死亡率11報告されています。いくつかのレポートはまた毒素 A、B、およびいくつかの非毒素抗原 (Cwp66、Cwp84、フリック、ありますと表層タンパク質 (Slp)) 再発・抗体反応に対する保護との関連を明らかにした12,13,14,15. これらの観察が誕生して最初受動免疫療法薬ターゲットc. ディフィシル毒素 B の (bezlotuxumab)、最近、米国食品医薬品局や欧州の医薬品が承認されています。再発の CDI16防災機関。不活化毒素または組換え毒素断片を使用して予防接種戦略もまた中開発17,18,19。これらの新しい治療上のアプローチは間違いなく大きいサンプルの大きさの複数の抗原に対する液性免疫応答を評価するための要件を刺激します。

今日、菌株、アイソタイプ特異抗体のc. ディフィシル抗原を同時に評価することができる市販の高スループット試金の著しい欠乏があります。今後の研究活動や臨床応用を容易にするためにこのようなアッセイを開発するニーズがあります。蛋白質のマイクロ アレイ、接触20または非接触にすることができますロボット システムを用いた顕微鏡スライド ベース表面にスポットの空間的組織化配列として個別に浄化された蛋白質の多数を固定する方法印刷ツール21。スポットのセル lysates、抗体、組織ホモジネート、内因性または組換え蛋白質やペプチド、体液薬22,23など複雑な混合物があります。

蛋白質のマイクロ アレイの技術では、標準的な社内の elisa 法にはなかった利点伝統的反difficile C.の抗体の応答を評価するために使用されている技術を提供しています。マルチ アイソタイプ特異抗体抗原、サンプル、および試薬の量を削減要件標的蛋白質のより広範なパネルの範囲を検出するために増加した能力が含まれますとより大きいを組み込むための強化された機能複数の内部品質管理 (QC) に加えて、技術的な複製の数は、1を測定します。マイクロ アレイは従ってより敏感、正確かつ再現性のある、大きなダイナミック レンジを持っています。これらの要因はマイクロ アレイに知られている蛋白質の大規模検出 Elisa に安く、潜在的に有利な代わりを作る。ただし、マイクロ アレイ技術の不利な点は高度精製抗原のパネルを確立し、技術的なプラットフォームの設定に関連付けられている大規模なアップ フロント コストから主に発生します。

蛋白質のマイクロ アレイは、臨床応用の診断および基本的な研究ツールとして過去 20 年間で広く使用されています。特定のアプリケーションは、タンパク質発現プロファイリング、酵素-基質の関係、バイオ マーカーのスクリーニング、宿主微生物間相互作用の解析に関する研究とプロファイリング抗体特異性23,24, 25,26,,2728。マラリア (原虫)29, HIV 130, インフルエンザ31, 重症急性呼吸器症候群 (SARS)32、ウイルス性出血熱33 を含む多くの新しい病原体の抗原/マイクロ アレイが確立されています。、ヘルペス ウイルスの34、および結核35。

簡単営業C. difficile反応性抗原マイクロ アレイ分析、マルチ アイソタイプとC. 株特異抗体の正確な正確なおよび特定の定量化を可能にするのに係る現在のプロトコルdifficileポリクローナル IVIg および血清中の抗原。ここで、elisa 法と同様、測定精度と再現性プロファイルと比較されたとき許容可能なマイクロ アレイ分析性能に係る代表の結果が含まれています。この試金は他の臨床サンプルをプロファイルにさらに開発できるし、CDI の分子基盤研究のための新しい標準を設定します。

Protocol

1. マイクロ プレートの準備 (患者の血清を実行する前に事前に定義された) を最適な濃度で印刷バッファー [PBS-トゥイーン-トレハロース (50 mM)] c. ディフィシル抗原を希釈: 毒素 (200 μ g/ミリリットル) と毒素 B (100 μ g/mL)、pCDTb (200 μ G/ml) と精製ネイティブ全体の Slp は、ribotypes 001、002、027 (200 μ g/mL) から派生します。注: 毒素 B 毒素 B 表現するひずみ CCUG 20309 (90 μ g/mL) から得?…

Representative Results

記述されていたプロトコルの主な手順を示すフローチャートを図 1に示します。図 2は、スピアマンの相関関係テスト テスト患者血清中の抗毒素 A と B レベル IgG および IgA のマイクロ アレイと ELISA との重要な契約を示しています。図 3は、下痢なし CF 患者、下痢、CDI 患者と HC 毒素は、毒素 B、およ?…

Discussion

このプロトコルでは、マイクロ アレイは (図 3および6) 患者血清および IVIg (図 5) の商業準備のdifficile C.タンパク質抗原に対する液性免疫応答を定義するための適切なプラットフォームを示しました。マイクロ アレイ技術が従来の elisa 法 (図 2) と比較した場合にも実行して測定内および測定間変動 (精度の許?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、エルメス交わりオラ Negm とターニャ モナハンとノッティンガム消化器病センターと NIHR ノッティンガム消化器疾患医療研究センターから個別の資金によって支えられました。

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer Digilab, Malborough, MA, USA N/A Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710. Innopsys N/A A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0 Innopsys N/A Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin Parallel Synthesis Technologies SMT-P75 Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator Thermo Scientific 41102426 To store the new and printed slides.
384-well plate Genetix X7022UN To prepare the antigens.
Plate cover Sigma Aldrich, UK CLS6570-100EA To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides Schott,  Germany 1064875 The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders GraceBio Labs, USA 204862 Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysate NIBSC PR-BA117-S Positive control
Tetanus Toxoid  Athens Research and Technology 04/150 Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707 Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-1 Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-2 Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-3 Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-4 Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701 Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-1M Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-2M Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090713 Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific Vector Labs BA-3080 Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT Southern Biotec 9052-08  Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT Southern Biotec 9060-08   Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT Southern Biotec 9210-08    Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT Southern Biotec 9190-08   Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated Vector Labs BA-3030 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT Southern Biotec 9130-08 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT Southern Biotec 9140-08   Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT Southern Biotec 9020-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter Thermo scientific 723-2520 Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, UK A7284 Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent Dako, UK S3022 To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5 eBioscience SA1011 Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) Toxins Group, Public Health England NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) Toxins Group, Public Health England NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb University of Bath  NA Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins Dublin City University  NA
Vigam (IVIg preparation 1) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Privigen (IVIg preparation 2) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Intratect (IVIg preparation 3) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
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References

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Negm, O. H., Hamed, M., Monaghan, T. M. A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection. J. Vis. Exp. (136), e57399, doi:10.3791/57399 (2018).
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