Här beskriver vi ett protokoll som använder laser fånga lokalt tillsammans med LC/MS-analys för att rumsligt-kvantifiera drog fördelningen inom pulmonell tuberkulos granulom. Metoden har bred tillämplighet för att kvantifiera läkemedelskoncentrationen i vävnader på hög spatial information.
Tuberkulos är fortfarande en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Förbättringar av befintliga läkemedel regimer och utvecklingen av nya behandlingar är angeläget. Doserade TB droger att nå och sterilisera bakterier inom dåligt-vaskulariserad nekrotisk regioner (caseum) av pulmonell granulom förmåga är avgörande för framgångsrik terapeutisk intervention. Effektiva behandlingsregimer måste därför innehålla läkemedel med gynnsamma caseum penetration egenskaper. Nuvarande LC/MS-metoder för att kvantifiera drog nivåer i biologiska vävnader har begränsad rumslig upplösning kapacitet, vilket gör det svårt att exakt fastställa absoluta läkemedelskoncentrationen inom små vävnad fack som de som finns inom nekrotiserande granulom. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar laser fånga lokalt (LCM) av patologiskt och distinkta vävnad regioner med LC/MS kvantifiering. Denna teknik ger absolut kvantifiering av droger inom granulombildning caseum, omgivande cellulära lesion och oengagerade lungvävnad och därför bestämmer exakt huruvida bactericidal koncentrationer uppnås. Förutom tuberkulos forskning har tekniken många potentiella tillämpningar för rumsligt-löst kvantifiering av läkemedel i sjuk vävnad.
Förmågan att rumsligt lösa och kvantifiera drog nivåer är ett viktigt krav för att fastställa om läkemedel mot tuberkulos nå bakteriell subpopulationer inom pulmonell lesioner på sterilisering koncentrationer1. Av särskild vikt är att fastställa drog penetration i nekrotisk kärnan av lesionen (kallas caseum), som vanligtvis innehåller det högsta antalet baciller och vara svårtillgängliga droger på grund av avsaknad av vaskularisering.
Traditionella metoder för att bedöma lesion penetration, som innebär homogenisering av exciderad pulmonell lesioner följt av vätskeextraktion och vätskekromatografi masspektrometri (LC/MS) analys, är mycket känsliga och selektiv för droger av intresse. Dessa metoder erbjuder dock dålig rumslig information, begränsad till storleken på den ursprungliga homogeniserad vävnaden. Mass spectrometry-baserad avbildning tillvägagångssätt, såsom matrix-assisted laser desorption jonisering (MALDI)2,3, desorption elektrospray jonisering (DESI)4 eller vätska-förstärkt yta utvinning5, 6 erbjuda mycket rumsligt-löst imaging funktioner, men direkt kvantifiering kan vara extremt utmanande eller omöjligt på grund av heterogena ion dämpning effekter och olika utvinning effektivitet av analyten från cellen olika eller vävnad typer7. Dessutom, är mest direkta vävnad MS bildgivande metoder till sin natur mindre känsliga än LC/MS på grund av kromatografisk separation av endogena arter som konkurrerar om jonisering och lägre vätskeextraktion effektiviteten av läkemedlet från vävnad.
Laser fånga lokalt (LCM) i kombination med LC/MS-analys har rutinmässigt används för att isolera och karakterisera olika vävnad regioner för proteomiska studier8,9 och nyligen utnyttjas för drogen kvantifiering i doseras djurvävnad10. Här presenterar vi ett optimerat protokoll tillämpa LCM kombination med LC/MS (LCM-LC/MS) analys för att kvantifiera anti-TB droger inom skilda granulombildning fack. I laser lokalt processen, är en UV-laser fokuserad genom mikroskopet målet på avsnittet vävnad, som klipper och isolerar området önskad vävnad genom att följa en väg som definieras av användaren. För gravitation-assisted LCM (den teknik som används för denna forskning), avsnittet vävnad är monterad på en tunn polymer membran objektglas (Husdjursvänlig eller penna) och vävnaden fångas i en samling tube cap placeras nedanför bilden. Läkemedel som utvinns från exciderad vävnad och kvantifieras med hjälp av standardmetoder för LC/MS. Mängden vävnad krävs samlas bestäms i sista hand från den förvänta koncentrationen av läkemedlet i vävnaden och känsligheten hos den LC/MS-metoden. För de flesta analyser av droger doseras på terapeutiska nivåer och analyseras med hjälp en rutinmässig trippel quadrupole masspektrometer, 3 miljoner µm2 (3 mm2) vävnad räcker yta.
Det här protokollet beskriver den kraftfulla kombinationen av rumsliga profilering och full kvantifiering erbjudit av LCM-LC/MS, absolut läkemedelskoncentrationen inom alla delområden av TB granulom. Tekniken kan också tillämpas för att fastställa läkemedelskoncentrationen i många olika sjuk vävnad som tillhandahåller viktig läkemedelsinformation upptäckt och utveckling.
Rumsligt-löst kvantifiering av droger inom pulmonell TB lesioner är skyldig att avgöra huruvida läkemedelsexponering når sterilisering koncentrationer till bakteriell populationer är bosatta i de olika lesion fack. Den LCM-LC/MS metod som beskrivs här kan absolut kvantifiering av anti-TB droger inom alla lesion fack, inklusive de bakterier-rika caseum, använder endast 1-3 vävnadssnitt totalt. Traditionella vävnad homogenisering och LC/MS-metoder för drogen kvantifiering i vävnad ofta saknar den rumsliga speci…
The authors have nothing to disclose.
Vi tacka Paul O’Brien, Marizel Mina och Isabella Freedman för djurförsök, Jacquie Gonzalez och Danielle Weiner från NIH/NIAID för hjälp med gammastrålning av kanin vävnader innan laser fånga lokalt och Jansy Sarathy för manuskript tankar och råd. Detta arbete stöddes av finansiering från Bill och Melinda Gates Foundation (OPP1174780) och NIH delade instrumentering bevilja 1S10OD018072. Vi tackar Eliseo A. Eugenin för att ge tillgång till mikroskopet Leica LMD 6500 och dela expertis och rådgivning. Inköp, och pågående stöd av, den LMD 6500 finansierades av The National Institute of Mental Health grant, MH096625, nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, NS105584, PHRI medel (till E.A.E) och GSK bidrag (till E.A.E).
New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
"Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |