التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن مقترنة بتحليل LC/MS مكانياً كمياً-توزيع المخدرات داخل حبيبية السل الرئوي. وقد النهج انطباق واسع لقياس تركيزات المخدرات داخل الأنسجة في التفاصيل المكانية العالية.
Abstract
السل لا يزال سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. إدخال تحسينات على نظم المخدرات القائمة وتطوير علاجات جديدة مطلوبة على وجه الاستعجال. القدرة لأدوية السل محسوبة للوصول إلى وتعقيم البكتيريا المناطق سيئة vascularized نخرية (كاسيوم) للرئة حبيبية أمر حاسم لنجاح التدخل العلاجي. يجب أن تتضمن الأنظمة العلاجية الفعالة لذلك المخدرات مع خصائص اختراق كاسيوم مواتية. أساليب LC/MS الحالية لقياس مستويات المخدرات في الأنسجة البيولوجية حدت من قدرات التحليل المكاني، مما يجعل من الصعب على دقة تحديد تركيزات المخدرات المطلقة داخل مقصورات الأنسجة الصغيرة مثل تلك التي عثر عليها داخل نخرية حبيبية. وهنا يقدم بروتوكول الجمع بين الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) من مناطق أنسجة مرضية متميزة مع التقدير الكمي LC/MS. هذا الأسلوب يوفر الكمي المطلق للمخدرات داخل كاسيوم الحبيبي، المحيطة بالآفة الخلوية وأنسجة الرئة بعيدين، وعليه، يحدد بدقة ما إذا كان يجري تحقيق تركيزات جراثيم. بالإضافة إلى بحوث السل، قد الأسلوب العديد من التطبيقات المحتملة لحل مكانياً الكمي للمخدرات في الأنسجة المريضة.
Introduction
القدرة على حل مكانياً وقياس مستويات المخدرات شرط حاسم لتحديد ما إذا كانت الأدوية المضادة للسل التوصل إلى الفئات السكانية الفرعية الجرثومية ضمن الآفات الرئوية في تعقيم تركيزات1. أهمية خاصة هو تحديد انتشار المخدرات في صلب نخرية الآفة (تسمى كاسيوم)، التي عادة ما تحتوي على أكبر عدد من العصيات وقد يكون موجوداً سيئة للمخدرات نظراً لعدم وجود الأوعية الدموية.
الأساليب التقليدية لتقييم انتشار الآفة، التي تنطوي على تجانس الآفات الرئوية قصت متبوعاً بالاستخلاص بالمذيبات وتحليل الطيف الكتلي (LC/MS) اللوني السائل، وهي بالغة الحساسية والانتقائي للمخدرات من الفائدة. ومع ذلك، توفر هذه الأساليب سوء إدارة المعلومات المكانية، تقتصر على حجم النسيج المتجانس الأصلي. النهج التصوير الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي، مثل الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين (استخدام)2،3، الامتزاز اليكتروسبراي التأين (ديسي)4 أو5الاستخراج السطحي المحسن السائل، 6 توفر قدرات التصوير جداً حل مكانياً، ولكن التقدير الكمي المباشر يمكن أن تكون صعبة جداً أو مستحيلاً بسبب تأثيرات قمع أيون غير متجانسة واختلاف كفاءات استخراج أكثر من الخلية مختلف أو أنواع الأنسجة7. بالإضافة إلى ذلك، النهج التصوير الأنسجة MS الأكثر مباشرة أصلاً أقل حساسية من LC/MS بسبب عدم الفصل الكروماتوغرافي للأنواع المحلية المتنافسة للتأين وكفاءة الاستخلاص بالمذيبات أقل من المخدرات من الأنسجة.
طبق بشكل روتيني لعزل وتوصيف مناطق أنسجة متميزة لدراسات البروتين8،9 ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) جنبا إلى جنب مع تحليل LC/MS واستخدمت مؤخرا لتقدير حجم المخدرات في مداوي 10من الأنسجة الحيوانية. نقدم هنا بروتوكولا أمثل تطبيق LCM جنبا إلى جنب مع تحليل LC/MS (LCM-LC/MS) التحديد الكمي للأدوية المضادة للسل داخل مقصورات الحبيبي متميزة. يتركز في عملية ميكروديسيكشن القبض على الليزر، ليزر الأشعة فوق البنفسجية من خلال الهدف المجهر على قسم الأنسجة، الذي يقطع ويعزل منطقة الأنسجة المطلوبة باتباع مسار المعرفة من قبل المستخدم. لمساعدة الجاذبية LCM (التقنية المستخدمة لهذا البحث)، يتم تحميل المقطع الأنسجة إلى شريحة غشاء بوليمر رقيقة (الحيوانات الأليفة أو القلم) والأنسجة يتم التقاطها في غطاء أنبوب جمع يقع أسفل الشريحة. وتستخرج من الأنسجة قصت المخدرات كمياً باستخدام نهج LC/MS قياسية. ويتحدد مقدار الأنسجة المطلوبة التي سيتم جمعها في نهاية المطاف من تركيز المتوقعة من المخدرات موجودة في الأنسجة وحساسية الطريقة LC/MS. لمعظم التحليلات المتعلقة بالمخدرات مداوي على المستويات العلاجية وتحليلها باستخدام الرباعي ثلاثي روتينية مطياف كتلة، 3 مليون ميكرون2 (3 مم2) من الأنسجة مساحة كافية.
يصف هذا البروتوكول مجموعة قوية من التنميط المكاني والكمي الكامل يقدمها LCM-LC/MS، توفير تركيزات المخدرات المطلقة في جميع مقصورات حبيبية السل. قد أيضا تطبيق هذه التقنية لتحديد المخدرات التركيزات في الأنسجة المريضة مختلفة العديد من توفير معلومات اكتشاف وتطوير العقاقير الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مطلوب حلها مكانياً الكمي للمخدرات داخل الآفات السل الرئوي لتحديد ما إذا كان التعرض للمخدرات تصل إلى تركيزات تعقيم بكتيرية السكان المقيمين داخل المقصورات الآفة مختلفة. LCM-LC/MS الأسلوب الموصوفة هنا تمكن الكمي المطلق للأدوية المضادة للسل داخل جميع المقصورات الآفة، بما في ذلك كاسيوم الغنية ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر أوبراين بول، مني مارزيل وايزابيلا فريدمان للتجارب على الحيوانات، Jacquie غونزاليس وينر دانييل من المعاهد الوطنية للصحة/نييد للحصول على تعليمات غاما تشعيع الأنسجة الأرنب قبل الليزر التقاط ميكروديسيكشن وساراثي جانسى للمخطوطات الأفكار والمشورة. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مشروع القانون، ومنح “وميليندا غيتس” (OPP1174780) والأجهزة المشتركة في المعاهد الوطنية للصحة 1S10OD018072. ونحن نشكر ايليسيو ألف يوجينين لتوفير الوصول إلى المجهر 6500 أمد إيكا وتبادل الخبرة والمشورة. شراء، والدعم المستمر، ومولت 6500 أمد منح “المعهد الوطني للصحة العقلية”، MH096625، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، NS105584، فري التمويل (إلى E.A.E) ومساهمات GSK (إلى E.A.E).
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
