Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.
Abstract
Tuberkulose ist nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Verbesserungen an vorhandenen Drogen-Therapien und die Entwicklung neuer Therapeutika werden dringend gebraucht. Die Fähigkeit der dosierten TB-Medikamente zu erreichen und Sterilisieren Bakterien innerhalb schlecht durchblutet nekrotische Regionen (Caseum) der pulmonale Granulome ist entscheidend für eine erfolgreiche therapeutische Intervention. Effektive therapeutische Therapien müssen daher Medikamente mit günstigen Caseum Eindringvermögen enthalten. Aktuelle LC/MS-Methoden zur Quantifizierung der Droge Ebenen in biologischen Geweben haben begrenzte räumliche Auflösung Fähigkeiten, macht es schwierig, genau festzustellen, absolute Droge Konzentrationen innerhalb kleiner Gewebe Fächer wie die gefunden in nekrotische Granulome. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit LC/MS Quantifizierung Laser Capture Microdissection (LCM) pathologisch unterschiedliche Gewebe Regionen kombinieren. Diese Technik bietet absolute Quantifizierung von Medikamenten innerhalb von Granulomen Caseum, um zelluläre Läsion und unbeteiligte Lungengewebe und daher genau bestimmt, ob bakterizide Konzentrationen erreicht werden. Neben der Tuberkuloseforschung hat die Technik viele Anwendungsmöglichkeiten für räumlich aufgelöst Quantifizierung von Drogen im erkrankten Gewebe.
Introduction
Die Fähigkeit, räumlich zu lösen und zu quantifizieren Droge Ebenen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Feststellung, ob Anti-Tuberkulose-Medikamente bakterielle Subpopulationen innerhalb pulmonale Läsionen bei Sterilisation Konzentrationen1erreichen. Von besonderer Bedeutung ist Medikament Eindringen in die nekrotischen Kern der Läsion (genannt Caseum), bestimmen, welche in der Regel enthält die höchste Anzahl von Bazillen und möglicherweise schlecht zugänglichen Drogen wegen fehlender Vaskularisierung.
Traditionelle Methoden zur Läsion eindringen, bewerten die Homogenisierung der ausgeschnittenen pulmonale Läsionen gefolgt von solvent-Extraktion und Analyse der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) betreffen, sind sehr empfindlich und selektiv für die Medikamente der Interesse. Diese Methoden bieten jedoch schlechte räumliche Informationen, auf die Größe des ursprünglichen homogenisierte Gewebe beschränkt. Massenspektrometrie-basierte Bildgebung Ansätze, wie Matrix-assisted Laser Desorption ionisation (MALDI)2,3, desorption Electrospray Ionisierung (DESI)4 oder Flüssigkeit-Erweiterte Oberfläche Extraktion5, 6 bieten sehr räumlich aufgelöst imaging-Funktionen, direkte Quantifizierung kann jedoch extrem schwierig oder unmöglich aufgrund der heterogenen Ion Unterdrückung Effekte und unterschiedliche Extraktion Wirkungsgrade von Analyten aus der einzelnen Zelle oder Gewebe7. Darüber hinaus sind direkteste Gewebe MS bildgebenden Ansätze von Natur aus weniger empfindlich als LC/MS aufgrund fehlender chromatographische Trennung von endogenen Arten konkurrieren für Ionisierung und die geringeren Wirkungsgrad der solvent-Extraktion der Droge aus Gewebe.
Laser Capture Microdissection (LCM) in Kombination mit LC/MS-Analyse wurde routinemäßig angewendet zu isolieren und zu charakterisieren verschiedene Gewebe Regionen für Proteomik8,9 Studien und vor kurzem verwendet für die Droge Quantifizierung dosiert tierisches Gewebe10. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte Protokoll Anwendung LCM kombiniert mit LC/MS (LCM-LC/MS)-Analyse, um Anti-TB-Medikamente in unterschiedlichen Granulom Fächer zu quantifizieren. Laser Capture Microdissection dabei konzentriert sich ein UV-Laser durch das Mikroskopobjektiv auf Gewebe, die schneidet und isoliert die gewünschte Gewebebereich ein Pfad durch den Benutzer definiert. Schwerkraft-unterstützte LCM (die Technik für diese Forschung verwendet), Abschnitt Gewebe wird auf einer dünnen Polymer-Membran-Folie (PET oder Stift) montiert und das Gewebe wird in einer Sammlung Rohr Kappe gelegen unterhalb der Folie erfasst. Die Medikamente werden aus dem ausgeschnittenen Gewebe extrahiert und quantifiziert mit LC/MS Standardansätze. Die Menge des Gewebes zu erhebenden erforderlich wird letztlich von der erwarteten Konzentration des Medikaments im Gewebe vorhanden und die Empfindlichkeit der LC/MS-Methode bestimmt. Für die meisten Analysen von Drogen auf therapeutische Ebenen dosiert und analysiert mit Hilfe einer routinemäßigen triple Quadrupol-Massenspektrometer, 3 Millionen µm2 (3 mm2) des Gewebes ist die Fläche ausreichend.
Dieses Protokoll beschreibt die kraftvolle Kombination von räumlichen Profilierung und vollständigen Quantifizierung von LCM-LC/MS, bietet absolute Droge Konzentrationen in allen Abteilen der TB Granulome angeboten. Die Technik kann auch angewendet werden, zu bestimmen, Droge-Konzentrationen in vielen verschiedenen erkrankten Geweben lebenswichtige Medikament Entdeckung und Entwicklung informieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Räumlich aufgelöst Quantifizierung von Medikamenten innerhalb pulmonale TB Läsionen ist erforderlich, um festzustellen, ob Arzneimittelexposition sterilisieren Konzentrationen an Bakterienpopulationen mit Wohnsitz innerhalb der verschiedenen Läsion Fächer erreicht. Die hier beschriebene LCM-LC/MS-Methode ermöglicht absolute Quantifizierung von Anti-TB-Medikamente in alle Fächer der Läsion, einschließlich der Bakterien-reiche Caseum, mit nur 1-3 Gewebeschnitte insgesamt. Traditionelle Gewebe Homogenisierung und L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Paul O’Brien, Marizel Mina und Isabella Freedman für Tierversuche, Jacquie Gonzalez und Danielle Weiner von NIH/NIAID für Hilfe mit Gammastrahlung von Kaninchen Gewebe vor dem Laser Capture Microdissection und Jansy Sarathy für Manuskript Gedanken und Ratschläge. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel aus der Bill und Melinda Gates Foundation (OPP1174780) und NIH geteilt Instrumentierung gewähren 1S10OD018072. Wir danken Eliseo A. Eugenin für den Zugang zu den Leica LMD 6500 Mikroskop und Austausch von Wissen und Beratung. Der Kauf und die laufende Unterstützung, der LMD-6500 wurde finanziert durch das National Institute of Mental Health Grant, MH096625, National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NS105584, PHRI Mittel (für E.A.E) und GSK Beiträge (zur E.A.E).
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
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