Romlig kvantifisering av narkotika i lunge tuberkulose lesjoner av Laser fange Microdissection væske kromatografi massespektrometri (MFM-LC/MS)
Summary
Her beskriver vi en protokoll som laser fange microdissection kombinert med LC/MS analyse romlig-kvantifisere narkotika distribusjoner i lunge tuberkulose granulomer. Tilnærmingen har bred anvendelse å kvantifisere narkotika konsentrasjoner i vev på romlige detaljer.
Abstract
Tuberkulose er fortsatt en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Forbedringer til eksisterende narkotika regimer og utviklingen av romanen therapeutics er presserende nødvendig. Dosed TB narkotika nå og sterilisere bakterier i dårlig Stangeriaceae nekrose regioner (caseum) av lunge granulomer er avgjørende for vellykket terapeutisk intervensjon. Effektiv terapeutisk regimer må derfor inneholde stoffer med gunstige caseum penetrasjon egenskaper. Gjeldende LC/MS metoder for kvantifisering narkotika nivåer i biologisk vev har begrenset romlig oppløsning evner, gjør det vanskelig å nøyaktig fastslå absolutt medikamentfri konsentrasjoner i liten vev avdelinger som finnes i nekrotisk granulomer. Her presenterer vi en protokoll forbinder laser fange microdissection (LCM) pathologically forskjellige vev regioner med LC/MS kvantifisering. Denne teknikken gir absolutt kvantifisering av narkotika granulom caseum, rundt mobilnettet lesjon og uninvolved lungevev, og derfor bestemmer nøyaktig om bakteriedrepende konsentrasjoner de oppnår. I tillegg tuberkulose forskning har teknikken mange bruksmuligheter for romlig løst kvantifisering av narkotika i sykt vev.
Introduction
Romlig løse og kvantifisere narkotika nivåer er en avgjørende forutsetning for å avgjøre om Anti-tuberkulose narkotika nå bakteriell subpopulasjoner i lunge lesjoner på sterilisering konsentrasjoner1. Spesielt viktig er å avgjøre narkotika penetrasjon i nekrotisk kjernen av lesjonen (kalt caseum), som vanligvis inneholder det høyeste antallet bakterier og kan være dårlig tilgjengelig til narkotika av endometrial blodkar.
Tradisjonelle metoder for å vurdere lesjon penetrasjon, som involverer homogenisering forbrukeravgift lunge lesjoner etterfulgt av løsemiddel utvinning og flytende kromatografi massespektrometri (LC/MS) analyse, er svært følsom og selektiv for narkotika av interesse. Disse metodene tilbyr imidlertid dårlig romlig informasjon, begrenset til størrelsen på den opprinnelige homogenisert vev. Masse massespektrometri tenkelig tilnærminger, som matrix-assistert laser desorpsjon ionization (MALDI)2,3, desorption electrospray ionization (tegning)4 eller væske forbedret overflaten utvinning5, 6 tilbyr svært romlig løst tenkelig evner, men direkte kvantifisering kan være svært utfordrende eller umulig heterogene ion undertrykkelse effekter og ulike utvinning effektiviteten av analytt fra ulike cellen eller vev typer7. I tillegg er mest direkte vev MS tenkelig tilnærminger iboende mindre sensitive enn LC/MS på grunn av manglende brukt kromatografiske separasjon av endogene konkurrerer om ionisering og lavere løsemiddel utvinning effektiviteten i stoffet fra vev.
Laser fange microdissection (LCM) kombinert med LC/MS analyse er rutinemessig brukes til å isolere og karakterisere ulike vev regioner for proteomic studier8,9 og nylig benyttes for narkotika kvantifisering i dosert dyr tissue10. Her presenterer vi en optimalisert protokoll bruke LCM kombinert med LC/MS (LCM-LC/MS) analyse for å kvantifisere anti-TB narkotika distinkte granulom rom. Laser fange microdissection prosessen, er en UV laser fokusert gjennom mikroskop målet på delen vev som kutt og isolerer ønsket vevet området følger en sti defineres av brukeren. For gravitasjon-assistert LCM (teknikken brukes for denne forskningen), delen vev er montert på en tynn polymer membran lysbildet (PET eller pennen) og vevet er fanget i en samling rør cap plassert under lysbildet. Narkotika er utdraget fra forbrukeravgift vevet og kvantifisert bruke standard LC/MS tilnærminger. Mengden vev må samles er til sist bestemt fra forventet konsentrasjonen av stoffet i vevet og følsomheten til metoden LC/MS. For de fleste analyser av narkotika dosert på terapeutisk nivåer og analysert ved hjelp av en rutinemessig trippel quadrupole masse spectrometer, 3 millioner µm2 (3 mm2) av vev er areal tilstrekkelig.
Denne protokollen beskriver den kraftige kombinasjonen av romlige profilering og full kvantifisering tilbys av LCM-LC/MS, gir absolutt medikamentfri konsentrasjoner i alle deler av TB granulomer. Teknikken kan også brukes til å avgjøre narkotika konsentrasjonene i mange forskjellige sykt vev viktig stoff og utvikling informasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Romlig løst kvantifisering av narkotika i lunge TB lesjoner er nødvendig for å avgjøre om narkotika eksponering når sterilisering konsentrasjoner til bakteriell befolkninger bosatt innenfor de ulike lesjon avdelinger. LCM-LC/MS metoden beskrevet her kan absolutt kvantifisering av anti-TB narkotika alle lesjon rom, inkludert bakterier-rike caseum, med bare 1-3 vev deler totalt. Tradisjonelle vev homogenisering og LC/MS tilnærminger for narkotika kvantifisering i vev ofte mangler romlige spesifisitet for å løse spe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Paul O’Brien, Marizel Mina og Isabella Freedman for dyreforsøk, Jacquie Gonzalez og Danielle Weiner fra NIH/NIAID for hjelp med gamma bestråling av kanin vev før laser fange microdissection og Jansy Sarathy for manuskriptet tanker og råd. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1174780) og NIH delt instrumentering gi 1S10OD018072. Vi takker Eliseo A. Eugenin gir tilgang til Leica LMD 6500 mikroskopet og dele ekspertise og råd. Kjøp, og kontinuerlig støtte av LMD 6500 ble finansiert av The National Institute of Mental Health grant, MH096625, National Institute av nevrologiske lidelser og slag, NS105584, PHRI midler (til E.A.E) og GSK bidrag (til E.A.E).
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
