Målet med denne protokollen er å tallfeste reparasjon av definerte DNA-protein krysskoblinger på plasmider DNA. Lesioned plasmider er transfekterte i mottakerens pattedyr linjer og lav-molekylær vekt høstes ved flere tid poeng etter hva. DNA reparasjon kinetics er kvantifisert benytter strand-spesifikke primer forlengelsen etterfulgt av qPCR.
Formålet med denne metoden er å gi en fleksibel, rask og kvantitative teknikk for å undersøke the kinetics av DNA-protein krysskobling (PPC) reparasjon i pattedyr linjer. I stedet for globalt assaying fjerning av xenobiotic oval-indusert eller spontane chromosomal DPC-fjerning, undersøker denne analysen reparasjon av en homogen, kjemisk definert leksjonen spesielt introdusert på ett område innenfor et plasmider DNA substrat. Viktigere, denne tilnærmingen unngår bruk av radioaktivt materiale og er ikke avhengig av dyre eller høyt spesialiserte teknologi. I stedet bruker den standard rekombinant DNA prosedyrer og allment tilgjengelig sanntid, kvantitativ polymerase kjedereaksjon (qPCR) instrumentering. Gitt den iboende fleksibiliteten av strategien utnyttet, størrelsen på krysskoblet protein og kjemiske sammenhengen og presis DNA kan sekvens sammenheng med webområdet vedlegg varieres for å løse de respektive bidragene til dette parametere for den generelle effektiviteten av DPC reparasjon. Bruker denne metoden, plasmider inneholder en områdespesifikk DPC var transfekterte i celler og lav molekylvekt DNA funnet på ulike tider etter hva. Gjenopprettede DNA er så utsatt strand-spesifikke primer forlengelse (SSPE) med en primer utfyllende til den skadede stranden av plasmider. Siden DPC lesjon blokker Taq DNA polymerase, kan forholdet mellom reparerte til un reparerte DNA kvantitativt vurderes ved hjelp av qPCR. Syklus-terskelverdier (CT) brukes til å beregne prosent reparasjon forskjellige tidspunkt i de respektive linjene. Denne SSPE-qPCR-metoden kan også brukes til å vurdere kvantitativt reparasjon kinetics noen DNA adduct som blokkerer Taq utvalg.
Beskrevet her kalles en PCR-baserte analysen SSPE-qPCR. Formålet med denne metoden er å tallfeste DPC reparasjon på plasmider DNA transfekterte til reparasjon mangelfulle og dyktig pattedyrceller. Denne analysen er rask, kvantitativ, fleksibelt direkte tiltak reparere aktivitet. Mens denne rapporten fokuserer på bruk av denne metodikken å studere reparasjon av DPCer, illustrerer resultatene nedenfor at reparasjon av noen lesjon som blokkerer Taq utvalg kan studeres med denne metoden.
Begrunnelsen bak utviklingen av denne metoden er å få innsikt i mekanismer som pattedyrceller reparere DPCer. I motsetning til andre typer DNA skade er DPCer svært mangfoldig1,2. Studier har vist at hundrevis av mobilnettet proteiner kan bli krysskoblet DNA og for hver protein som finnes, i prinsippet, tallrike aminosyre siden kjeder som kunne bli covalently knyttet til mobilnettet DNA3. I tillegg finnes det mange kjemiske festepunkter for proteiner til DNA ryggraden, inkludert flere stillinger nucleotide baser og ribose sukker4,5. Denne kjemiske mangfold reiser prospektet at forskjellige biokjemiske trasé kan stoles på å reparere typer DPCer. Det var med denne bekymringen Husk at SSPE-qPCR analysen ble utviklet.
Flere teknikker er utviklet for å få innsikt i molekylærbiologi i mobilnettet DPC reparasjon. Nedenfor gir en oversikt over de store tilnærmingene som er utviklet, med en oppsummering av store styrkene og svakhetene begge har. Det er verdt å understreke at mens dette sammendraget fokuserer på studier av DPC reparasjon i pattedyr celle kultur systemer, betydelige bidrag til dagens modell for DPC reparasjon er gjort ved hjelp av mikrobielle og celle-frie systemer som ikke omtales i dette manuskriptet.
Kanskje er den enkleste strategien som kan tas å få innsikt i genetikk av DPC reparasjon å vurdere respektive følsomheten til celledød observert i vill-type og mutant celler utsatt for agenter som induserer DPCer6,7. Denne strategien er relativt rask, billig, og krever ikke spesialisert kompetanse utover muligheten til å utføre grunnleggende celle kultur teknikker. Counterbalancing fordelene er mange begrensninger til denne tilnærmingen inkludert følgende. Først måler analysen ikke direkte DNA-reparasjon. Arbeider forutsetningen underliggende denne strategien er at inaktivere mutasjoner i gener som koder relevante DNA reparasjon proteiner resultater en opphopning av DNA skade som utløser programmert celledød. Men kan mutasjoner i gener som koder ikke-DNA-reparasjon proteiner i prinsippet, forbedre (eller redusere) mobilnettet følsomhet for xenobiotic oval-indusert celledød. Andre agenter oppretter DPCer alltid indusere andre typer DNA skade (et unntak er 5-aza-2-deoxycytadine, men denne agenten også reduserer mobilnettet methyltransferase nivåer8). Derfor er det tenkelig at forbedret mobilnettet overfølsomhet for agent i spørsmålet kan gjenspeile defekter i reparasjon av interstrand krysskoblinger eller andre lesjoner. Tredje, som nevnt ovenfor, DPCer representerer en svært heterogen klasse består av ulike typer kjemiske krysskoblinger, med annet protein partnere. Det er mulig at mens reparasjon av én eller flere underordnede typer av disse lesjoner kan endres i en bestemt genetisk bakgrunn, denne forskjellen ikke kan være tilstrekkelig til å vesentlig endre mobilnettet overfølsomhet til døden av denne agenten. I sammendraget, mens denne strategien representerer et attraktivt utgangspunkt, markere begrensningene som beskrives ovenfor betydningen av å forfølge andre, mer direkte metoder for å studere the kinetics av DPC reparasjon.
En rekke relaterte tilnærminger har blitt utviklet for å oppnå dette målet. For eksempel har etterforskere utviklet metoder for å skille mellom “gratis” DNA og ‘protein-bundet’ DNA9,10,11. Bruke disse tilnærminger, er det mulig å sammenligne stabil nivåer av DPCer eller følgende eksponering til en DPC-produserende agent i forskjellig genetisk bakgrunn. De to strategiene som er mest brukt involvere skille DPC inneholder DNA fra gratis DNA en nitrocellulose membran bindende strategi eller KCl/SDS nedbør12,13. I tidligere tilnærming er celler lysed og gått gjennom et nitrocellulose-filter. Fordi nitrocellulose binder protein, beholder filteret protein-tilknyttet DNA, tillater gratis DNA å passere. I den siste strategien er protein-bundet DNA separert fra gratis DNA basert på det faktum at SDS binder protein, men DNA, og kan være forårsaket av tillegg av KCl. Følgelig blir protein-tilknyttet DNA uløselig mens ubundet DNA forblir i løsningen. DPC inneholder DNA kan deretter bli quantitated med radiolabeled thymidine (hvis cellene var opprinnelig metabolically merket) eller en DNA-selektiv fluorescerende farge som Hoechst 33258. Disse metodene er reproduserbare og krever et lite antall trinn. Men gir de ikke informasjon om naturen av den kjemiske krysskobling som protein er knyttet til DNA. Videre er det viktig å merke seg disse analyser kan overvurdere DPC reparere feilaktig scoret ufullstendig reparasjon, dvsproteolytisk bearbeiding å mindre DNA-peptid krysskoblinger som ikke kan være lett fanget eller bidrar, bona fide DNA reparasjon.
Comet analyser kan brukes å visualisere DPC-formasjonen i celler14. I disse eksperimentene, tilstedeværelse av DPCer redusere DNA overføringen som deretter kan reverseres ved pretreating med proteinasen K. Lengden på halen kan derfor brukes til å beregne DPC-formasjonen. Men som nevnt ovenfor, opprette DPC-forming stoffer andre typer DNA skade som kan endre hale lengde. Denne protokollen er også svært teknisk og krever kompetanse og opplæring i AC confocal bildebehandling.
Massespektrometri kan brukes å studere DPC reparasjon kinetics etter behandling med crosslinking agenter15,16,17. Disse eksperimentene behandle celler med DPC-danner agenter og isolere DPCer via biotin fange eller fenol: kloroform (1:1) utvinning. Massespektrometri kan deretter brukes til å identifisere krysskoblet proteiner eller quantitate antall DPCer dannet over tid. Den store fordelen med denne tilnærmingen er natur data produsert. Er det mulig å presist katalogen typer proteiner som blir krysskoblet etter eksponering for en xenobiotic oval, men denne protokollen er dyrt, tidkrevende, og er begrenset av krysskobling som kan oppdages.
Maizels et al. utviklet en følsom ‘RADAR”(rask tilnærming til DNA adduct utvinning) analysen å quantitate immunodetection DNA-protein addukter samt en ELISA-baserte RADAR analysen18,19. Disse analyser er spesielt nyttig for overlapping DNA-protein mellomprodukter som transiently danne i celler og generere prøver egnet for masse spectroscopy å identifisere nye protein addukter. Denne immunodetection analysen avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer til å fange de DNA-protein er krysskoblet, og derfor kan ikke være i stand til å oppdage degradert DNA-peptid addukter skjemaet under reparasjon. Nylig en bestemt DPC reparere veien til utryddelse og en DNA-avhengige metalloprotease Spartan ble oppdaget i som DPCer er proteolyzed med mindre peptider under reparasjon20,21. Arvede mutasjoner i dette genet er forbundet med Ruijs-Aalfs syndrom i mennesker, en sykdom karakterisert ved genomisk ustabilitet, tidlig aldring og leverkreft22. Mus med genmodifiserte spartanske genet defekter vise lignende fenotyper23.
Verten celle aktivering av transcriptional aktivitet har vært brukt til å studere reparasjon av definerte lesjoner på transfekterte plasmider DNA underlag24,25. I disse eksperimentene, plasmider med DPCs (eller andre typer DNA lesjoner) som blokkerer transkripsjon av en journalist, som luciferase, er transfekterte i celler. Luminescence målinger tatt 24-72 h senere så er korrelert med DPC reparasjon. Men disse indirekte reparasjon analyser er i stand til å oppdage reparasjonshendelser tidligere enn 24 timer etter transfection og ikke kan skille mellom RNA polymerase omkjøringsvei av delvis reparerte underlag og fullstendig reparasjon.
Hver av metodene beskrevet ovenfor har fordeler og har bidratt til dagens modell for DPC reparasjon. Men SSPE-qPCR analysen omgår flere av begrensningene knyttet til disse andre tilnærminger og dermed kan gi mer spesifikk informasjon DPC reparasjonsmekanismene. For eksempel kan SSPE-qPCR analysen direkte måle reparasjon av områdespesifikke DPCer på DNA i intakt pattedyrceller. Denne metoden er allsidig og har blitt brukt til å få reparasjon resultater etter transfection i hamster og humane cellelinjer. Hva av plasmider kan utføres med lipofection eller electroporation i kulturperler pattedyr linjer. Det også sikrer at bare reparasjon av definerte DPCer er målt, og ikke andre typer DNA skade forårsaket av de fleste DPC-danner agenter. SSPE-qPCR er enkel å utføre, billig og rask. Resultatene ved hjelp av denne analysen har oppdaget reparasjonshendelser så tidlig som 2t etter hva. Bruker denne metoden, kan variabler som kan påvirke DPC reparasjon resultater studeres på en måte som er sensitiv og effektiv. For eksempel ennå rollen transkripsjon i DPC reparasjon vurderes grundig. På grunn av fleksibiliteten til SSPE-qPCR analysen, kan crosslinking stedet for DPC redigeres for å løse dette spørsmålet. Innføring av en opprinnelse i replikering til DPC-bærende plasmider kan i tillegg brukes til å løse påvirkning av replikering på DPC reparasjon. I tillegg kan flere krysskoblinger opprettes på plasmider undersøke forskjellene i reparasjon av et enkelt DPC versus flere krysskoblinger. Dette er spørsmål som ville være vanskelig å besvare med chromosomal DNA, men kan enkelt løses ved hjelp av SSPE-qPCR analysen. Samlet, SSPE-qPCR analysen krever renset, plasmider DNA i mikrogram mengder som inneholder en leksjonen på en kjent plassering. Addukter foruten DPC kan brukes i denne analysen, men lesjonen må være dugelig av sperring utvidelse av Taq utvalg.
Metoden SSPE-qPCR tilbyr mange fordeler over andre tilnærminger ved å undersøke reparasjon av en homogen befolkning som inneholder en enkelt, definert DPC leksjonen. Det er bemerkelsesverdig at i tillegg til å kontrollere identiteten til protein og typen kjemisk krysskobling brukes til å koble protein til DNA, er det mulig å enkelt manipulere sekvens sammenheng som DPC lesjonen er innført. Vi har utforsket påvirkning på DPC reparasjon av introdusere lesjonen enten malen eller koding strand av en plasmider nedstrøms av en aktiv promotor locus. På samme måte er vi i ferd med å undersøke påvirkning på DPC reparasjon av replikering bruker en M13 plasmider inneholder en SV40 opprinnelse i replikering transfekterte i HEK293T celler. Analysen beskrevet her direkte tiltak DPC reparasjon, i motsetning til andre strategier som verten celle aktivering som indirekte estimater reparere aktivitet24,25. I tillegg er systemet robust, følsom og kvantitative. I motsetning til andre systemer, som måler DPC fjerning, denne analysen finner bare fullstendig reparasjonshendelser, dvs, det krever ikke bare at DPC lesjonen fjernes, men at integriteten til dobbeltsidig DNA være fullt restaurert17. Dette er fordi abasic nettsteder og kutt og brudd i phosphodiester ryggraden blokkere analysen så effektivt som de opprinnelige DPC lesjon29.
Mens denne rapporten fokuserer på en bestemt type DPC, som ble opprettet av borohydride fangst av et enzym reaksjon mellomliggende, vi utvikler for tiden tilnærminger for å studere reparasjon av DPCer andre proteiner og lesjoner som protein sammenhengen til DNA oppstår gjennom nukleosid base, i stedet for ribose plasseringen. Bruker reductive amination, har vi opprettet protein og peptid krysskoblinger festet til guanine eller cytosine av en DNA primer30. Disse oligonucleotides var renset til homogenitet og brukes til å generere supercoiled plasmider inneholder DNA-protein og DNA-peptid krysskoblinger. Mens effektiviteten av disse reaksjonene er noe redusert i forhold til den oxoguanine glycosylase krysskobling fremgangsmåten beskrevet i detalj ovenfor, de var likevel vellykket og tillater undersøkelse av reparasjon av disse underlag i vill-type og nukleotid excision reparasjon-mangelfull pattedyr cellelinjer. Vi har også brukt SSPE-qPCR analysen for å studere reparasjon av oxoguanine lesjoner og en syntetisk ribose-kolesterol konjugert, som tidligere ble vist repareres via mobilnettet nukleotid excision reparasjon maskiner31. Som figur 2 viser grafisk, reparasjon av noen leksjonen at blokker primer utvidelse av Taq utvalg kan i prinsippet måles ved hjelp av SSPE-qPCR analysen.
Aktuelle modeller for DPC reparasjon foreslår at større DPCs (> 10 kDa) er utsatt for proteolytisk bearbeiding mindre peptid lesjon før fjerning32,33,34. Mest sannsynlig kandidater ansvarlig for denne proteolyse er proteasome eller en bestemt protease i menneskelige celler kalt spartanske20,21,35,36,37, 38. videre etterforskning rollene av disse proteaser kan bli utført med SSPE-qPCR analysen. Proteasome hemmere kan brukes til å pretreat celler før transfection med DPC inneholder underlag. Alternativt kan spartanske knockdown linjer være transfected med skadet Plasmidene å belyse sin rolle i proteolyse av større DPCer.
Uansett metoden brukes til å opprette de er krysskoblet eller av DNA lesjonen natur, er det verdt å understreke at SSPE-qPCR-metodikk er kritisk avhengig av evnen til å generere betydelige mengder homogen DPC-plasmider substrat. Trinn avgjørende for denne analysen inkluderer rensing av covalently, lukket-sirkulært plasmider etter primer utvidelse for å eliminere alle nicked eller lineær plasmider molekyler. Disse forurensningene må elimineres for å sikre at alle etterfølgende DPC reparasjon observert ikke er på grunn av nick-rettet eller dobbel-strand pause-rettet reparasjonsprosessene. Unnlatelse av å få tilstrekkelig mengder supercoiled DNA etter primer forlengelsen reaksjoner kan overvinnes ved å variere forholdet mellom oligonucleotide til enkelt-strandet DNA. Et annet viktig skritt for metoden SSPE-qPCR er crosslinking effektiviteten av protein til plasmider. I denne studien, en effektiv og enzymatiske reaksjonen ble brukt til krysskobling oxoguanine glycosylase protein til en 8-oxo-guanine lesjon. Sub optimal crosslinking kan forbedres ved å variere hvor mye protein lagt til reaksjonen.
Mens resultatene som beskrives i denne rapporten, avhengig av lipofection å innføre DPC reparasjon underlag i mottakerens celler, er det ingen grunn, en priori, andre transfections-metoder kan ikke brukes. Vi har utført forstudier og observert at electroporation39 kan også brukes. Men det er verdt å merke seg at i vår erfaring, electroporation hva effektivitet er redusert sammenlignet med lipofection, og vi fant det nødvendig å bruke bærer DNA (opptil 5 µg) i tillegg til de 1,5 µg av DPC substrat for å få reparasjonsdata. Samlet gir metoden SSPE-qPCR beskrevet ovenfor en innovativ måte å utelukkende undersøke DPC reparasjon på plasmider DNA og generere ny innsikt i DNA skade responsen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner støttes av trening Grant 5T32HL007741. Vi takker Natalia Tretyakova (University of Minnesota) og Ashis Basu (Universitetet i Connecticut) og deres lab medlemmer for støtte og tekniske råd under tidlig og mellomliggende stadier av dette arbeidet.
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |