Målet med denne protokol er at kvantificere reparation af definerede DNA-protein krydsbindinger på plasmid DNA. Lesioned plasmider er transfekteret ind i modtagerens pattedyr cellelinjer og lav-Molekylær vægt høstet på flere gang point efter Transfektion. DNA reparation kinetik er kvantificeret benytter strand-specifikke primer forlængelse efterfulgt af qPCR.
Formålet med denne metode er at levere en fleksibel, hurtig og kvantitativ teknik til at undersøge kinetik af DNA-protein bitmapgenkendelse (DPC) reparation i pattedyr cellelinjer. I stedet for globalt boltpistoler fjernelse af xenobiotiske-induceret eller spontan kromosomale DPC fjernelse, undersøger dette assay reparation af en homogen, kemisk definerede læsion specifikt indført på et websted inden for en plasmid DNA substrat. Vigtigst, denne tilgang undgår brug af radioaktivt materiale og er ikke afhængig af dyre eller højt specialiseret teknologi. I stedet, det er baseret på standard rekombinant DNA procedurer og bredt tilgængelige real-time, kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) instrumentation. I betragtning af den iboende fleksibilitet i strategien udnyttet, størrelsen af crosslinked protein og arten af den kemiske kobling og præcis DNA kan sekvens rammerne af webstedet udlæg varieres for at løse de respektive bidrag af disse parametre til den samlede effektivitet af DPC reparation. Brug denne metode, plasmider, der indeholder en lokationsspecifik DPC blev transfekteret i celler og lavmolekylære DNA inddrives på forskellige tidspunkter efter Transfektion. Gendannede DNA er derefter udsat for strand-specifikke primer forlængelse (SSPE) ved hjælp af et supplement til den beskadigede del af plasmidet primer. Siden DPC læsion blokke Taq DNA polymerase, kan forholdet mellem repareret til un-reparerede DNA kvantitativt vurderes ved hjælp af qPCR. Cyklus tærskelværdier (CT) bruges til at beregne procent reparation på forskellige tidspunkter i de respektive cellelinjer. Denne SSPE-qPCR metode kan også bruges til at vurdere kvantitativt reparation kinetik af enhver DNA addukt at blokke Taq-polymerase.
Beskrevet heri er en PCR-baseret analyse betegnes SSPE-qPCR. Formålet med denne metode er at kvantificere DPC reparation på plasmid DNA transfekteret til reparation mangelfuld og dygtige pattedyrsceller. Denne analyse er hurtige, kvantitative, yderst fleksible og direkte foranstaltninger reparation aktivitet. Mens denne betænkning fokuserer på brug af denne metode til at studere reparation af DPC’er, illustrerer resultaterne præsenteres nedenfor at reparation af enhver læsion som blokerer Taq-polymerase kan studeres ved hjælp af denne metode.
Rationalet bag udviklingen af denne metode er at få indsigt i de mekanismer, hvorigennem pattedyrceller reparere DPC’er. I modsætning til andre typer af DNA-skader er DPC’er massivt forskelligartede1,2. Undersøgelser har vist, at hundredvis af cellulære proteiner kan blive crosslinked DNA og der for hvert protein der er i princippet, talrige aminosyre sidekæder, der kunne blive kovalent tilknyttet cellulære DNA3. Derudover er der mange kemiske fastgøringspunkter til proteiner på DNA-backbone, herunder flere positioner på nukleotid baser samt ribose sukker4,5. Denne kemiske mangfoldighed rejser den udsigten til, at forskellige biokemiske veje kan påberåbes til at reparere forskellige typer af DPC’er. Det var med denne bekymring i tankerne at SSPE-qPCR analysen blev udviklet.
Flere teknikker er blevet udviklet for at få indsigt i Molekylærbiologi af cellulære DPC reparation. Følgende giver et overblik over de store tilgange, der er blevet udviklet, med et resumé af store styrker og svagheder hver besidder. Det er værd at understrege, at mens dette resumé fokuserer på studier af DPC reparation i pattedyr celle kultur systemer, betydelige bidrag til den nuværende model af DPC reparation er foretaget ved hjælp af mikrobielle og celle-fri systemer, der ikke er drøftet i denne Håndskriftet.
Måske er den nemmeste strategi, der kan træffes for at få indsigt i genetik af DPC reparation at vurdere de respektive følsomhed til celledød observeret i wild-type og muterede celler udsat for stoffer, der inducerer DPC’er6,7. Denne strategi er relativt hurtigt, billigt, og kræver ikke specialiseret ekspertise ud over evnen til at udføre grundlæggende celle kultur teknikker. Modvægt disse fordele er talrige begrænsninger for denne tilgang, herunder følgende. For det første måler analysen ikke direkte DNA reparation. Den arbejdshypotese, ligger til grund for denne strategi er at inaktivere mutationer i gener kodning relevante DNA reparation proteiner resulterer i en ophobning af DNA skade at udløsere programmeret celledød. Men mutationer i gener kodning ikke-DNA-reparation proteiner kunne, hovedstol, forbedre (eller reducere) cellulære følsomhed til xenobiotiske-induceret celledød. Andet, agenter, der skaber DPC’er uvægerligt fremkalde andre former for DNA-skader (en undtagelse er 5-aza-2′-deoxycytadine, men denne agent også udtømmer cellulære methyltransferase niveauer8). Det er derfor tænkeligt, at forbedrede cellulære overfølsomhed overfor den pågældende agent kan afspejle defekter i reparation af interstrand krydsbindinger eller andre læsioner. Tredje, som blev nævnt ovenfor, DPC’er repræsenterer en stærkt heterogen klasse består af forskellige typer af kemiske krydsbindinger, der involverer forskellige protein partnere. Det er muligt, at mens reparation af en eller flere undertyper af disse læsioner kan ændres i en særlige genetiske baggrund, denne forskel ikke kan være tilstrækkeligt markant ændre cellulære overfølsomhed over for døden induceret af denne agent. I Resumé, mens denne strategi udgør et attraktivt udgangspunkt, fremhæver de begrænsninger, der er skitseret ovenfor betydningen af at forfølge andre, mere direkte metoder til at studere kinetik af DPC reparation.
En række relaterede tilgange er blevet udviklet for at nå dette mål. For eksempel, har efterforskere udviklet metoder til at skelne mellem ‘gratis’ DNA og protein bundet DNA9,10,11. Med disse tilgange, er det muligt at sammenligne steady state niveauer af DPC’er eller efter eksponering for en DPC-producerende agent i forskellige genetiske baggrunde. De to strategier, der har været mest udbredt inddrage adskille DPC-holdige DNA fra gratis DNA ved hjælp af enten en nitrocellulose membran bindende strategi eller KCl/SDS nedbør12,13. I den tidligere tilgang er celler mængden og passeret gennem en nitrocellulose filter. Fordi nitrocellulose binder protein, bevarer filteret protein-linked DNA, tillader gratis DNA at passere igennem. I den sidstnævnte strategi er protein-bundne DNA adskilt fra gratis DNA faktum, at SDS binder sig til protein, men ikke DNA, og kan blive fremskyndet ved tilsætning af KCl. Derfor, protein-linked DNA bliver uopløselig mens ubundne DNA forbliver i opløsning. DPC-holdige DNA kan derefter være quantitated ved hjælp af radiolabeled thymidine (hvis celler var oprindeligt metabolisk mærket) eller ved en DNA-selektiv fluorescerende farvestof som Hoechst 33258. Disse metoder er reproducerbare og kræver et lille antal trin. De giver imidlertid ikke oplysninger om arten af de kemiske bitmapgenkendelse hvorigennem protein er knyttet til DNA. Derudover er det vigtigt at bemærke, disse assays kan overvurdere DPC reparation af falsk scoring inkomplet reparation, dvs, proteolytiske forarbejdning til mindre DNA-peptid krydsbindinger, der ikke måske være så let fanget eller udfældet som bona fide DNA reparation.
Komet assays kan bruges til at visualisere DPC dannelse i celler14. I disse eksperimenter, tilstedeværelsen af DPC’er formindske DNA migration, som derefter kan vendes ved forbehandling med proteinase K. Længden af halen kan derfor bruges til at anslå DPC dannelse. Men som nævnt ovenfor, DPC-dannende stoffer oprette andre typer af DNA-skader, som kunne ændre hale længde. Denne protokol er også meget tekniske og kræver ekspertise og uddannelse i Konfokal billedbehandling.
Massespektrometri kan bruges til at studere DPC reparation kinetik efter behandling med crosslinking agenter15,16,17. Disse eksperimenter behandle celler med DPC-dannende agents og isolere DPC’er via biotin capture eller phenol: chloroform (1:1) udvinding. Massespektrometri kan derefter bruges til at identificere crosslinked proteiner eller kvantificere mængden af DPC’er dannet over tid. Den største fordel ved denne tilgang er arten af de data, der er produceret. Det er muligt at præcist katalog typer af proteiner, der bliver crosslinked efter udsættelse for en xenobiotiske, men denne protokol er dyrt, tidskrævende, og er begrænset af typen af bitmapgenkendelse, der kan detekteres.
Maizels et al. udviklet en følsom RADAR (hurtig tilgang til DNA addukt recovery) analysen til at kvantificere immunodetection af DNA-protein adukter samt en ELISA-baserede RADAR assay18,19. Disse assays er især nyttige for fældefangst DNA-protein mellemprodukter, der forbigående dannes i cellerne og generere prøver egnet til masse spektroskopi til at identificere nye protein adukter. Denne immunodetection assay afhængig af tilgængeligheden af antistoffer til at fange DNA-protein bitmapgenkendelse og derfor kan ikke være i stand til at opdage forringede DNA-peptid adukter formularen under reparation. For nylig, en specifik DPC reparere pathway knyttet til DNA-replikation og DNA-afhængige metalloprotease Spartan blev opdaget i hvilke DPC’er er proteolyzed til mindre peptider under reparation20,21. Nedarvede mutationer i dette gen er forbundet med Ruijs-Aalfs syndrom hos mennesker, en sygdom karakteriseret ved genomisk ustabilitet, for tidlig aldring og leverkræft22. Mus med gensplejsede spartanske gendefekter vise tilsvarende fænotyper23.
Vært-cellen reaktivering af transcriptional aktivitet er blevet brugt til at studere reparation af definerede læsioner på transfekteret plasmid DNA substrater24,25. I disse eksperimenter, plasmid som indeholder DPC’er (eller andre former for DNA læsioner) at blokere en transkription af en reporter, såsom luciferase, er transfekteret i celler. Luminescence målinger taget 24-72 h er senere derefter korreleret med DPC reparation. Men disse indirekte reparation assays er i stand til at opdage reparation begivenheder tidligere end 24 timer efter Transfektion og kan ikke skelne mellem RNA-polymerase bypass af delvist repareret substrater og komplet reparation.
Hver af de metoder beskrevet ovenfor har fordele og har bidraget til den nuværende model af DPC reparation. Men SSPE-qPCR assay omgår flere af de begrænsninger i forbindelse med disse andre tilgange og derfor kan give mere specifik indsigt i DPC reparations-mekanismer. SSPE-qPCR assay kan eksempelvis direkte måle reparation af lokationsspecifikke DPC’er på DNA i intakt pattedyrsceller. Denne metode er alsidige og har været brugt til at opnå reparation resultater efter Transfektion i hamster og menneskelige cellelinjer. Transfektion af plasmidet kan udføres ved hjælp af lipofection eller elektroporation i kulturperler pattedyr cellelinjer. Det sikrer også, at kun reparation af definerede DPC’er er målt, og ikke andre typer af DNA-skader induceret af de fleste DPC-dannende agents. SSPE-qPCR er nemme at udføre, billig og hurtig. Resultater opnået ved hjælp af denne analyse har fundet reparation begivenheder så tidligt som 2 h efter Transfektion. Brug denne metode, kan variabler, der kan påvirke DPC reparation resultater studeres på en måde, der er følsomt og effektivt. For eksempel har rollen af transkription i DPC reparation endnu skal evalueres nøje. På grund af fleksibiliteten i SSPE-qPCR assay, kan webstedet crosslinking af DPC manipuleres til at behandle dette spørgsmål. Desuden kan indførelse af en oprindelse af replikering til DPC-bærende plasmid bruges til at behandle indflydelse af replikering på DPC reparation. Derudover kan flere krydsbindinger oprettes på plasmidet at undersøge forskelle i reparation af en enkelt DPC versus flere krydsbindinger. Disse er spørgsmål, der ville være vanskeligt at besvare med kromosomale DNA men kan let løses ved hjælp af SSPE-qPCR assay. Samlede, SSPE-qPCR analysen kræver renset, plasmid DNA i mikrogram mængder indeholdende en læsion af en kendt placering. Adukter udover DPC kan bruges i denne analyse, dog læsion skal være i stand til at blokere udvidelsen af Taq-polymerase.
SSPE-qPCR metode giver adskillige fordele i forhold til andre tilgange ved at undersøge reparation af en homogen befolkning, der indeholder en enkelt, definerede DPC læsion. Det er bemærkelsesværdigt, at ud over at kontrollere identiteten af protein og type af kemiske bitmapgenkendelse bruges til at forbinde proteinet til DNA, er det muligt at nemt manipulere sekvens sammenhæng som DPC læsion er indført. Vi har udforsket indflydelse på DPC reparation af at indføre læsion på enten skabelonen eller kodning strand af en plasmid nedstrøms af en aktiv promotor locus. Vi er ligeledes i færd med at undersøge indflydelse på DPC reparation af replikering ved hjælp af en M13 plasmid som indeholder en SV40 oprindelsen af replikering transfekteret ind i HEK293T celler. Analysen beskrevet heri direkte foranstaltninger DPC reparation, i modsætning til andre strategier som vært celle reaktivering, indirekte skøn reparere aktivitet24,25. Desuden er ordningen robust, følsomme og kvantitative. I modsætning til andre systemer, som måler DPC fjernelse, denne analyse registrerer kun komplet reparation begivenheder, dvs., det kræver ikke kun at DPC læsion fjernes men at integriteten af de duplex DNA være fuldt restaureret17. Dette er fordi abasic websteder og rifter eller pauser i phosphodiester rygrad blokere analysen så effektivt som de oprindelige DPC læsion29.
Mens denne betænkning fokuserer på en bestemt type af DPC, som blev skabt af brændstof diffusering af et enzym reaktion mellemliggende, vi i øjeblikket udvikler metoder til at studere reparation af DPC’er involverer andre proteiner og læsioner som protein koblingen til DNA opstår gennem nucleoside base i stedet for ribose holdning. Bruger reduktiv undersøgelsesområde, har vi skabt protein og peptid krydsbindinger knyttet til guanin eller cytosin base af et DNA primer30. Disse oligonukleotider blev renset til homogenitet og bruges til at generere supercoiled plasmider, der indeholder DNA-proteiner og DNA-peptid krydsbindinger. Mens effektiviteten af disse reaktioner er noget reduceret i forhold til den oxoguanine glycosylase bitmapgenkendelse metode beskrevet i detaljer ovenfor, de var ikke desto mindre vellykket og muliggøre kontrol af reparation af disse substrater i wild-type og nukleotid excision reparation-mangelfuld pattedyr cellelinjer. Vi har også brugt SSPE-qPCR analysen for at studere reparation af oxoguanine læsioner og en syntetisk ribose-kolesterol konjugat, som tidligere blev vist repareres via cellular nukleotid excision reparation maskiner31. Som figur 2 viser grafisk, reparation af enhver læsion at blokke primer udvidelse af Taq-polymerase kan, i princippet måles ved hjælp af SSPE-qPCR assay.
Nuværende modeller af DPC reparation tyder på, at større DPC’er (> 10 kDa) udsættes for proteolytisk forarbejdning til mindre peptid læsion inden fjernelse32,33,34. Mest sandsynlige kandidater ansvarlig for denne proteolyse er proteasom eller en specifik protease i humane celler opkaldt spartanske20,21,35,36,37, 38. yderligere undersøgelser i rollerne af disse proteaser kan gennemføres ved hjælp af SSPE-qPCR assay. Proteasom hæmmere kan anvendes til at forbehandle celler før Transfektion med DPC-holdige substrater. Alternativt, spartanske knockdown cellelinjer kunne være transfekteret med beskadigede plasmider at belyse sin rolle i proteolyse af større DPC’er.
Uanset metoden bruges til at oprette bitmapgenkendelse eller arten af DNA læsion, er det værd at understrege, at metoden SSPE-qPCR er kritisk afhængige af evnen til at generere betydelige mængder af homogene DPC-plasmid substrat. Trin vigtigt for denne analyse omfatter rensning af kovalent, lukket-cirkulære plasmid efter primer udvidelse for at eliminere enhver hakker eller lineær plasmid molekyler. Disse forurenende stoffer skal fjernes for at sikre, at enhver efterfølgende DPC reparation observeret ikke er på grund af nick-instrueret eller dobbelt-strenget pause-instrueret reparationsprocesser. Manglende evne til at skaffe tilstrækkelige mængder af supercoiled DNA efter primer udvidelse reaktioner kan overvindes ved at variere forholdet mellem oligonukleotid til enkeltstrenget DNA. Et andet vigtigt skridt for metoden SSPE-qPCR er crosslinking effektiviteten af protein til plasmidet. I denne undersøgelse, en effektiv, enzymatisk reaktion blev brugt til bitmapgenkendelse oxoguanine glycosylase protein til en 8-oxo-guanin læsion. Sub optimal crosslinking kan forbedres ved at variere mængden af protein føjet til reaktionen.
Mens de resultater, der er beskrevet i denne rapport har påberåbt sig lipofection at indføre DPC reparation substrater i modtagerens celler, der er ingen grund, på forhånd, andre transfections metoder kunne ikke anvendes. Vi har udført indledende undersøgelser og observeret at elektroporation39 kan også bruges. Men det er værd at bemærke, at vores erfaring, elektroporation Transfektion effektivitet er reduceret i forhold til lipofection og vi fandt det nødvendigt at bruge carrier DNA (op til 5 µg) ud over de 1,5 µg af DPC substrat for at få reparation data. Samlet set giver SSPE-qPCR metode beskrevet ovenfor en innovativ måde at udelukkende undersøger DPC reparation på plasmid DNA og generere ny indsigt i DNA skader svar.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner understøttes af uddannelse Grant 5T32HL007741. Vi takker Natalia Tretyakova (University of Minnesota) og Ashis Basu (University of Connecticut) og deres lab medlemmer for støtte og tekniske rådgivning under den tidlige og mellemliggende faser af dette arbejde.
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |