Vi presenterer en protokoll for å isolere nerveceller, makrofager og microglia fra larver sebrafisk hjerner under fysiologiske og patologiske forhold. På isolasjon, er RNA Hentet fra disse cellene til å analysere gene expression profilen. Denne protokollen gir for innsamling av høy kvalitet RNA nedstrøms analyse som qPCR og transcriptomics.
For å få en detaljert forståelse av rollen annerledes CNS celler under utvikling eller etablering og progresjon av hjernen patologi, er det viktig å isolere disse cellene uten å endre deres gene expression profil. Sebrafisk-modellen gir et stort antall transgene fisk linjer som merkes spesifikke celletyper; for eksempel nerveceller i NBT:DsRed linjen eller makrofager/microglia i mpeg1:eGFP-linjen. Videre antistoffer er utviklet til stain bestemte celler, for eksempel microglia med 4C 4 antistoff.
Her beskriver vi isolering av neurons, makrofager og microglia fra larver sebrafisk hjerner. Sentralt i denne protokollen er unngå en enzymatisk vev fordøyelsen ved 37 ° C, som kunne endre mobilnettet profiler. I stedet brukes et mekanisk system av vev homogenisering på 4 ° C. Denne protokollen innebærer homogenisering av hjernen i cellen suspensjon, deres immun flekker og isolasjon av neurons, makrofager og microglia av FACS. Etterpå vi RNA utvunnet av disse cellene og evalueres kvalitet/kvantitet. Vi klarte å få RNA av høy kvalitet (RNA integritet nummer (RIN) > 7) til å utføre qPCR på makrofager/microglia og neurons, og transcriptomic analyse av microglia. Dette gir bedre karakteristikk av disse cellene, i tillegg til en klarere forståelse om deres rolle i utvikling og patologi.
Kunnskap om hjernens utvikling og brain sykdommer har forbedret det siste tiåret siden den første kvantifiseringen av musen hjernen transcriptomes1. Faktisk gir genomet bredt gene expression analyse oss tilgang til genetisk informasjon om hjernevev og celler som kan utfylle og forbedre observasjoner gjort med andre teknikker og verktøy.
Sebrafisk er en potent biologiske modell, lett å avle og endre genetisk; dens optisk gjennomsiktighet på larver stadier kan live bildebehandling observasjoner2. Dessverre, i forhold til menneskelig og musen, antall tilgjengelige antistoffer utføre immuno-flekk er ganske lav. For å bøte på dette er transgene sebrafisk fisk linjer lett laget av genetisk modifisere fisk å uttrykke fluorescerende proteiner under celle type bestemt arrangører. Transgene sebrafisk linjer har blitt brukt i siste for å studere rollen til makrofager og microglia under sentralnervesystemet (CNS) utvikling og sykdom3,4,5,6. Vi må imidlertid forstå endringer i byggkorn under de respektive celletyper for å få en detaljert forståelse av disse prosessene. Til dette målet, vi utviklet en eksperimentell metode for å isolere spesielt celler som nerveceller, makrofager og microglia fra 3 til 8 dager etter befruktning (dpf) larver sebrafisk hjerner. For etableringen av protokollen jobbet vi med transgene fisk linjer som uttrykker grønne fluorescerende protein (GFP) i makrofager/microglia under macrophage-uttrykt genet promoter (mpeg1:eGFP) og DsRed i neurons under den nevrale ß-tubulin selskapet (NBT:DsRed)7,8,9. Videre utført vi immuno-farging av microglia med 4C 4, en mus monoklonalt antistoff som spesifikt flekker sebrafisk microglia10,11. Etterpå, ribonukleinsyre (RNA) er Hentet fra disse cellene for videre kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) eller transcriptome analyser. Denne protokollen er designet for å effektivt homogenize hjernevevet fra sebrafisk Larvene; samle nerveceller, makrofager/microglia og microglia uten endring av deres plasma membranen integritet og endelig ekstra RNA fra disse cellene i høy kvalitet (RIN > 7) og utføre genomisk analyse. I motsetning til tidligere publiserte undersøkelser som bruker trypsin behandling på 37 ° C for å fordøye hjernen vev12,13, fremmer denne protokollen arbeid på 4 ° C til RNA utvinning skritt for å redusere modifikasjoner av gene expression profilen. Dette trinnet er avgjørende som microglia og makrofager er svært følsom celler som reagere på endringer i deres microenvironment umiddelbart ved å endre deres gene expression profil og polarisering14,15, 16.
Protokollen, beskrevet her i detalj, viser isolering av neurons, makrofager og microglia fra sebrafisk larver hjernen, men nesten, det kan tilpasses til en annen celle stede i hjernen – enten ved hjelp av transgene fisk linjer eller merket med spesifikke antistoffer. Denne metoden vil tillate bedre karakteristikk av CNS cellene til sine genom bredt gene expression analyser og vil bidra til å forstå deres rolle under utvikling og brain sykdommer.
Eksperimentell protokollen beskrevet her representerer en robust og effektiv metode for å isolere hjerneceller fra sebrafisk larver fra 3 til 8 dpf. Viktigere, er dette den første protokollen som tillater at bestemte isolering av microglia fra larver sebrafisk hjerner. Protokollen er utformet for å bevare cellemembranen integritet og for å redusere potensielle endringer av genuttrykk forekommer under behandling. Dette siste punktet er avgjørende for relevansen av resultatene basert på analyse av de isolerte mobilnettet genomisk profilene. Faktisk microglia og macrophage polarisering er sterkt påvirket av deres microenvironment. Ved 37 ° C, ville disse cellene ha endret gene expression profilen svar på eksperimentelle forhold (skade (transection) respons). Derfor var det avgjørende å utføre dette eksperimentet på 4 ° C før RNA ekstraksjon, tregere cellulære prosesser og metabolic aktivitetene. Videre ble mekanisk hjernen vev homogenisering på 4 ° C valgt i stedet for enzymatisk vev fordøyelsen ved 37 ° C å unngå av genet uttrykket profiler.
Det er viktig å understreke at denne metoden er veldig rask; innen en dag kan flere hjernen celle populasjoner isoleres fra minst to forskjellige eksperimentelle forhold og deres RNA utdraget. Den totale lengden på protokollen avhenger av antall Larvene brukt til hver betingelse som transection larver hoder er begrensende skritt (∼ 350 hoder/h). Generelt, for å arbeide med microglia 3, 5 og 7 dpf anbefales mudderbunn ∼ 600 hoder per test for å få nok RNA trekke ut (tabell 1). Microglia representerer den cellen med lavest gir (ca 112 celler per hode på 7 dpf), antall hoder kan reduseres for andre celletyper inkludert makrofager (ca. 170 celler per hode på 7 dpf).
En annen fordel med denne protokollen er at når innstillingene på FACS sorter er etablert, kan de samme innstillingene brukes for forskjellige eksperimenter. Det har blitt observert at celle populasjoner passer perfekt fra et eksperiment til en annen med gates tidligere designet, viser reproduserbarhet eksperimenter ved hjelp av denne metoden.
En liten ulempe med denne metoden er relativt lave mengden RNA som er høstet. Denne begrensningen er imidlertid mer en biologisk problemet enn et teknisk problem, som antall microglia er svært lav i tidlige stadier av hjernens utvikling (tabell 1). På grunn av dette lave antallet av samlet, må forsterkning skritt vurderes å utføre genomet bredt gene expression analyse. Heldigvis produserer fremgangsmåten forsterkning tilstrekkelig mengder høykvalitets cDNA. Dermed kan globale endringer i genet uttrykket profiler av isolerte celler studeres.
Avslutningsvis gir denne protokollen en robust metode for å isolere og studere ulike CNS celletyper fra larver sebrafisk hjerner. Dette kan brukes for å få en dypere forståelse av disse cellene under utvikling så vel som å studere deres rolle i sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Claire Davis og Dr. Veronique Miron (dronningens Medical Research Institute, Edinburgh, United Kingdome) for første hjelp og diskusjoner om eksperimentell tilnærming og QMRI Flow cytometri og celle sortering anlegget. Dette arbeidet ble støttet av en kreft forskning UK karriere etablering prisen til Dr. Dirk Sieger.
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Hepes | Gibco | 15630-056 | |
D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
10 mL syringe | BD | 302188 | |
Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
FACS tubes | BD | 352063 | |
Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
RNaseZap | Ambion | AM9780 |