Mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione
Summary
Qui descriviamo un protocollo per stabilire e coltura umano e del mouse-derivato organoids gastrico 3-dimensionale (3D) e il metodo per il trasferimento di organoids 3D di un monostrato di 2-dimensionale. L’uso del monolayer epiteliale gastrico come un’analisi novella di zero-ferita per studi di rigenerazione è anche descritto.
Abstract
Studi in vitro della riparazione arrotolata gastrico in genere comporta l’uso di linee cellulari di cancro gastrico in un dosaggio zero-ferita di migrazione e proliferazione cellulare. Una limitazione critica di tali dosaggi, tuttavia, è loro assortimento omogeneo di tipi cellulari. Riparazione è un processo complesso che richiede l’interazione di diversi tipi di cellule. Pertanto, studiare una cultura priva di sottotipi cellulari, è una preoccupazione che dovrà essere superata se vogliamo comprendere il processo di riparazione. Il modello organoid gastrico può alleviare questo problema per cui la raccolta eterogenea di tipi di cellule strettamente riflette quella dell’epitelio gastrico o altri tessuti in vivo. Ha dimostrato qui è un romanzo in vitro dosaggio zero-ferita derivato da umani o organoids 3-dimensionale del mouse che possono essere trasferiti a un monostrato epiteliale gastrico come entrambi organoids intatto o come una sospensione unicellulare di dissociato organoids. L’obiettivo del protocollo è quello di stabilire monostrati epiteliali gastrici organoid-derivato che possono essere utilizzati in un sistema di analisi novella zero-ferita per studiare rigenerazione gastrico.
Introduction
L’uso di metodi di zero-ferita è un metodo popolare per lo studio della rigenerazione e riparazione1,2,3,4,5,6. La metodologia proposta può essere usata per studiare specificamente rigenerazione gastrico e Helicobacter pylori colonizzazione. In passato, linee cellulari di cancro gastrico sono stati utilizzati come mezzo per studiare l’ Helicobacter pylori (H. pylori) infezione1,2 e fino a cancro gastrico recentemente linee cellulari quali le cellule AGS erano favorito1 ,2,3,4. Una limitazione di colture di cellule di cancro gastrico è loro fallimento di ricapitolare la diversità cellulare dell’epitelio gastrico. Per tentare di risolvere questa limitazione, dimostrato che qui è l’istituzione e il trasferimento dei primari umani – e mouse-derivati 3-dimensionale fundic gastrica organoids (FGOs) di un monostrato epiteliale gastrico per ferita guarigione saggi basati su un metodo modificato prima descritto da Schlaermann et al. 7 dimostriamo che gastrici monostrati epiteliali derivati da Tosato 3D FGOs gastrico o FGO-derivato singole cellule conservano una composizione cellulare polarizzata che strettamente rappresenta che dell’epitelio gastrico in vivo. Dato che le linee cellulari del cancro gastrico non dimostrano la composizione cellulare che questa tecnica consente di visualizzare, l’attuale protocollo ha un vantaggio rispetto ai metodi alternativi dosaggio zero-ferita. Questa metodologia è stata ottimizzata per cui gli strati monomolecolari possono essere stabilita da organoids intero o da una sospensione singola cella da organoids dissociate e placcato utilizzando una matrice della membrana basale o collagene-rivestimento. L’obiettivo generale del presente protocollo è quello di stabilire che un organoid derivato colture monostrato epiteliale gastrica per un’analisi di guarigione della ferita romanzo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’attuale protocollo dettagli l’istituzione di monostrati epiteliali gastrico umano e del mouse-derivato che può essere utilizzato per le analisi di zero-ferita. Il protocollo dipende il concetto dei tessuti di isolamento da primari umani (o mouse) di cellule staminali residenti e un protocollo modificato è pubblicato da Schlaermann et al.7. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo qui per stabilire un confluenti e polarizzati monostrato epiteliale gastrica che esprime i princi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH (NIDDK) 5 DK083402 R01-07 concedere (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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