Mus - og menneske-avledet primære mage Epithelial Monolayer kultur for studier av gjenfødelse
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å etablere og dyrking menneske – og mus-avledet 3-dimensjonale (3D) gastrisk organoids og metoden for overføring av 3D organoids til en 2-dimensjonal monolayer. Bruk av mage epithelial monolayer som en roman scratch-sår analysen for regenerering studier er også beskrevet.
Abstract
In vitro studier av mage såret reparasjon vanligvis innebærer bruk av magekreft cellelinjer i en scratch-sår analysen av mobilnettet spredning og overføring. En kritisk begrensning av slike analyser, er imidlertid deres homogen utvalg av mobilnettet. Reparer er en komplisert prosess som krever samspillet flere celletyper. Derfor, for å studere en kultur uten mobilnettet subtyper, er et problem som må overvinnes hvis vi skal forstå reparasjonsprosessen. Gastrisk organoid modellen kan lindre problemet der heterogene samlingen celletyper tett gjenspeiler mage epitel eller andre innfødte vev i vivo. Vist her er en roman, i vitro scratch-sår analysen avledet fra menneskelige eller musen 3-dimensjonale organoids som kan deretter overføres til en mage epithelial monolayer som enten intakt organoids eller en enkeltcelle suspensjon av avstand organoids. Målet med protokollen er å etablere organoid-avledet mage epithelial monolayers som kan brukes i en roman scratch-sår analysen system for å studere mage gjenfødelse.
Introduction
Bruk av scratch-sår analyser er en populær metode for å studere reparasjon og regeneration1,2,3,4,5,6. Foreslåtte metodikken kan brukes spesielt studere mage regenerasjon og Helicobacter pylori colonization. Tidligere magekreft linjer har blitt brukt som et middel til å studere Helicobacter pylori (H. pylori) infeksjon1,2 og til sist magekreft linjer som AGS celler var favoriserte1 ,2,3,4. En begrensning av magekreft cellekulturer er deres manglende recapitulate mobilnettet mangfoldet av mage epitel. For å prøve å løse denne begrensningen vist her er etablering og overføring av primære menneske – og mus-avledet 3-dimensjonale fundic gastrisk organoids (FGOs) til en mage epithelial monolayer for sår helbredelse analyser basert på en modifisert metode først beskrevet av Schlaermann et al. 7 vi viser at mage epithelial monolayers avledet fra skåret 3D gastrisk FGOs eller FGO-avledet enkeltceller beholde en polarisert mobilnettet sammensetning som tett representerer det av mage epitel i vivo. Gitt at magekreft cellelinjer ikke samordnet celle sammensetningen denne teknikken viser, har gjeldende protokollen en fordel over alternative scratch-sår analysen metoder. Denne metoden har blitt optimalisert der monolayers kan være etablerte fra hele organoids eller en enkeltcelle suspensjon fra avstand organoids og belagt med en kjeller membran matrise eller kollagen belegg. Det overordnede målet med denne protokollen er å etablere en organoid avledet mage epithelial monolayer kulturer for en roman sår helbredelse analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gjeldende protokollen detaljer etableringen av menneske – og mus-avledet mage epithelial monolayers som kan brukes til bunnen-sår analyser. Protokollen avhenger begrepet bosatt stamceller isolert fra primære human (eller mus) vev og er en endret protokoll først utgitt av Schlaermann et al7. Vi har spesielt optimalisert protokollen her for å etablere en confluent og polarisert mage epithelial monolayer som uttrykker store celle linjene som finnes mage epitel i vivo. Magesår r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet ved NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 gi (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
