Мыши и человека, полученных первичных желудка эпителиальных монослойном культивировании для изучения регенерации
Summary
Здесь мы описываем протокол для создания и культивирования человека и мыши, полученных 3-мерной organoids желудка (3D) и метод для передачи 3D organoids 2-мерной монослоя. Использование желудочного эпителиальных монослоя как Роман пробирного скретч раны для регенерации исследования также описал.
Abstract
В vitro исследования желудка рану ремонта обычно предполагает использование линий клеток рака желудка в скретч раны assay пролиферации и миграции. Одно из критических ограничений таких анализов, однако, является их однородной ассортимент клеточных типов. Ремонт — сложный процесс, который требует взаимодействия нескольких типов клеток. Таким образом для изучения культуры лишены клеточных подтипы, является опасение, что необходимо преодолеть, если мы хотим понять процесс восстановления. Желудка органоид модель может облегчить эту проблему, которой разнородной коллекции типов клеток тесно отражает эпителии желудка или другой родной тканей в естественных условиях. Продемонстрировали здесь-это роман, в пробирке скретч раны пробирного производным от человека или мыши 3-мерной organoids, которые затем могут быть переданы желудка эпителиальных монослоя, как либо нетронутыми organoids или одну ячейку перерыва в отрыве organoids. Цель Протокола заключается в создании производных органоид желудка эпителиальных монослои которые могут использоваться в системе Роман скретч раны пробирного для изучения желудка регенерации.
Introduction
Использование скретч раны анализов является популярным методом для изучения ремонта и регенерации1,2,3,4,5,6. Предлагаемая методология может использоваться специально изучать желудка регенерации и колонизации Helicobacter pylori . В прошлом линии клеток рака желудка были использованы как средство для изучения инфекции Helicobacter pylori (H. пилорусов)1,2 и до недавно желудка рак клеточных линий, таких как AGS клетки были благоприятствования1 ,2,3,4. Одним из ограничений культур клеток рака желудка является их неспособность пилки сотовой разнообразие желудка эпителия. Чтобы попытаться решить это ограничение, продемонстрировали здесь является создание и передачи первичных человека и мыши производных 3-мерной fundic желудка organoids (FGOs) для желудка эпителиальных монослоя для исцеления анализов раны сначала на основе модифицированного метода характеризуется Schlaermann и др. 7 мы продемонстрировали, что желудка эпителиальных монослои, производный от сдвиговых 3D желудочного FGOs или FGO-производные отдельные клетки сохраняют поляризованные клеточный состав, который тесно представляет что желудка эпителия в vivo. Учитывая, что линии клеток рака желудка не демонстрируют клеточный состав, который отображает эту технику, текущий протокол имеет преимущество над альтернативных скретч раны пробирного методы. Эта методология была оптимизирована, whereby монослои может быть установленным от всей organoids или одну ячейку подвеска от диссоциированных organoids и покрытием с помощью базальной мембраны матрицы или коллагена покрытием. Общая цель настоящего Протокола заключается в установить органоид производными желудка эпителиальных монослоя культур для исцеления assay Роман рану.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол подробности создания человека и мыши, полученных желудка эпителиальных монослои которые могут использоваться для анализов скретч раны. Протокол зависит от концепции резидентов стволовых клеток тканей изоляции от первичного человека (или мыши) и измененный Протокол ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана на низ (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 Грант (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
