Summary

Mus - och mänskliga-härledda primära Gastric epitelial enskiktslager kultur för studien av regenerering

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att upprätta och odla mänskliga – och mus-härledda 3-dimensionell (3D) gastric organoids, och metoden för överföring av 3D organoids till en 2-dimensionell enskiktslager. Användningen av den gastric epitelial enskiktslager som en roman scratch-sår-analysen för regenerering studier beskrivs också.

Abstract

In vitro studier av gastric såret reparation innebär vanligtvis användning av gastric cancer cellinjer i en scratch-sår-analys av cellulär proliferation och migration. En viktig begränsning av sådana analyser, är dock deras homogen sortiment av cellulära typer. Reparation är en komplex process som kräver samverkan mellan flera celltyper. Därför, för att studera en kultur saknar cellulär subtyper, är ett problem som måste övervinnas om vi ska förstå reparationsprocessen. Den gastric organoid modellen kan lindra problemet varigenom den heterogena samlingen av celltyper nära återspeglar gastric epitel eller andra infödda vävnader i vivo. Visat här är en roman, in vitro- scratch-såret analys härrör från mänskliga eller mus 3-dimensionella organoids som sedan kan överföras till en gastric epitelial enskiktslager som antingen intakt organoids eller som en enda cellsuspension av skiljas organoids. Syftet med protokollet är att upprätta organoid-derived gastric epitelial enskiktslager som kan användas i en roman scratch-såret assay system för att studera gastric regenerering.

Introduction

Användning av scratch-såret analyser är en populär metod för att studera reparation och förnyelse1,2,3,4,5,6. Den föreslagna metoden kan användas för att specifikt studera gastric regenerering och Helicobacter pylori kolonisering. I förflutnan, gastric cancer cellinjer har använts som ett sätt för att studera Helicobacter pylori (H. pylori) infektion1,2 och fram till nyligen gastric cancer cellinjer som AGS celler var gynnade1 ,2,3,4. En begränsning av magsäckscancer cellkulturer är deras misslyckande att sammanfatta den cellulära mångfalden av gastric epitel. För att försöka ta itu med denna begränsning, visat här är etablering och överföring av primära mänskliga – och mus-härledda 3-dimensionella fundic gastric organoids (FGOs) att en gastric epitelial enskiktslager för såret helande analyser baserat på en modifierad metod först beskrivs av Schlaermann et al. 7 vi bevisa att gastric epitelial enskiktslager härrör från klippt 3D gastric FGOs eller FGO-derived enstaka celler behålla en polariserad cellulära sammansättning som nära motsvarar som av gastric epitel invivo. Med tanke på att gastric cancer cellinjer inte visar cell sammansättning denna teknik visar, har det nuvarande protokollet en fördel över alternativa scratch-såret testmetoderna. Denna metod har optimerats whereby enskiktslager kan vara etablerade från hela organoids eller från en enda cell avstängning från dissocierade organoids och guldpläterade med en basalmembranet matris eller kollagen-beläggning. Det övergripande målet med detta protokoll är att upprätta en organoid härrör gastric epitelial enskiktslager kulturer för en roman såret helande analys.

Protocol

För att undvika kontaminering, utföra protokollet i sin helhet inom en steril vävnadsodling huva. Mänsklig fundic vävnad samlades in från patienter som genomgår hylsa gastrektomi enligt godkända University of Cincinnati IRB protokollet (IRB protokollnummer: 2015-4869).Alla mus studier godkändes av University of Cincinnati institutionella djurens vård och användning kommittén (IACUC) som upprätthåller en American Association of Assessment och ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) anläggning.<…

Representative Results

Organoids härleddes från corpus/kroppen av människan eller fundus av mus magen vävnader (figur 1A). Efter antingen kollagenas eller EDTA rötning av mänskliga – eller mus-härledda magen vävnad respektive är körtlar inbäddade i basalmembranet matris och odlade för 6-7 dagar (figur 1A). Figur 1B visar bildandet av mänskliga-derived gastric organoids (huFGOs) som sedan har överförts till e…

Discussion

Det nuvarande protokollet Detaljer inrättandet av mänskliga – och mus-härledda gastric epitelial enskiktslager som kan användas för scratch-såret analyser. Protokollet är beroende av begreppet hemvist stem cell isolering från primära mänskliga (eller mus) vävnader och är en modifierad protokollet först publicerades av Schlaermann et al7. Vi har särskilt optimerad protokollet här för att upprätta en konfluenta och polariserade gastric epitelial enskiktslager som uttrycker …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete var stött av NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 bevilja (YZ).

Materials

Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) Life Technologies 12634-010
GlutaMAX (L-glutamine) Life Technologies 25030-081
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Amphotericin B/Gentamicin Thermo Scientific R01510
Kanamycin Thermo Fisher RO1510
HEPES Buffer Sigma Aldrich H0887
n-Acetylcystine Sigma Aldrich A9165
N2 Life Technologies 17502-048
B27 Life Technologies 12587-010
BMP Inhibitor (Noggin) Pepro Tech 250-38
Gastrin Tocris 3006
EGF Pepro Tech 315-09
FGF10 Pepro Tech 100-26
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Y-27632 ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TGF-β Inhibitor Tocris 2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBS Fisher 21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum FBS
OPTIMEM Invitrogen
0.22µM filter Fisher 099-720-004
37 °C Water Bath
Collagenase Type 1 Worthington  LS004214
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
Kimwipes (tissue paper) Fischer Scientific 06-666C
125 mL round bottom flask
1 in (25 mm) stir bar
Rubber Septa
Sterile Gauze
Stir Plate
Ring Stand
Ring Stand Clamps
Sterile petri dish
18 G needles of 1.5 in length Thermo Fisher 305196
20 G spinal needles of 3.5 in length Thermo Fisher 405182
12-well cell culture treated plate Midwest Scientific 92012
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) Fisher CB-40230C
Sterile Razor Blades
Wide-tip tweezers
Curved Hemostatic Forceps
200 µL wide pipette tips Thermo Fisher 02-707-134
5 mL cell culture test tubes Fisher 14-956-3C
Oxygen Tank with rubber hosing
1 g D-Sorbitol
Sucrose Fisher SS-500
Dissecting microscope
Dissecting Tray
Rocking Table
Rat Tail Collagen Type 1 Life Technologies A10483-01
Cell culture grade glacial acetic acid Fisher A38-212
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
2-well chamber slide Thermo Fisher 155380
12-well Transwell (polyester membrane inserts) Corning 3460
Cell scraper Corning 353086
Accutase (cell detachment solution) Stemcell Technologies 7920
263/8 G syringe Thermo Fisher 309625
Razor blade
L Cells L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).   N/A
HEK-293T Rspondin secreting cells A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ).   N/A
HK-ATPase Primary Antibody Invitrogen SC-374094
E-Cadherinn SantaCruz sc-59778
UEA1 Sigma Aldrich L9006
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) ThermoFisher Scientific R37114

References

  1. Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
  2. Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
  4. Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
  5. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  6. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
  9. Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
  10. Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
  11. Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
  12. Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
  13. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
  14. Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
check_url/kr/57435?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Teal, E., Steele, N. G., Chakrabarti, J., Holokai, L., Zavros, Y. Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57435, doi:10.3791/57435 (2018).

View Video