Här beskriver vi ett protokoll för att upprätta och odla mänskliga – och mus-härledda 3-dimensionell (3D) gastric organoids, och metoden för överföring av 3D organoids till en 2-dimensionell enskiktslager. Användningen av den gastric epitelial enskiktslager som en roman scratch-sår-analysen för regenerering studier beskrivs också.
In vitro studier av gastric såret reparation innebär vanligtvis användning av gastric cancer cellinjer i en scratch-sår-analys av cellulär proliferation och migration. En viktig begränsning av sådana analyser, är dock deras homogen sortiment av cellulära typer. Reparation är en komplex process som kräver samverkan mellan flera celltyper. Därför, för att studera en kultur saknar cellulär subtyper, är ett problem som måste övervinnas om vi ska förstå reparationsprocessen. Den gastric organoid modellen kan lindra problemet varigenom den heterogena samlingen av celltyper nära återspeglar gastric epitel eller andra infödda vävnader i vivo. Visat här är en roman, in vitro- scratch-såret analys härrör från mänskliga eller mus 3-dimensionella organoids som sedan kan överföras till en gastric epitelial enskiktslager som antingen intakt organoids eller som en enda cellsuspension av skiljas organoids. Syftet med protokollet är att upprätta organoid-derived gastric epitelial enskiktslager som kan användas i en roman scratch-såret assay system för att studera gastric regenerering.
Användning av scratch-såret analyser är en populär metod för att studera reparation och förnyelse1,2,3,4,5,6. Den föreslagna metoden kan användas för att specifikt studera gastric regenerering och Helicobacter pylori kolonisering. I förflutnan, gastric cancer cellinjer har använts som ett sätt för att studera Helicobacter pylori (H. pylori) infektion1,2 och fram till nyligen gastric cancer cellinjer som AGS celler var gynnade1 ,2,3,4. En begränsning av magsäckscancer cellkulturer är deras misslyckande att sammanfatta den cellulära mångfalden av gastric epitel. För att försöka ta itu med denna begränsning, visat här är etablering och överföring av primära mänskliga – och mus-härledda 3-dimensionella fundic gastric organoids (FGOs) att en gastric epitelial enskiktslager för såret helande analyser baserat på en modifierad metod först beskrivs av Schlaermann et al. 7 vi bevisa att gastric epitelial enskiktslager härrör från klippt 3D gastric FGOs eller FGO-derived enstaka celler behålla en polariserad cellulära sammansättning som nära motsvarar som av gastric epitel invivo. Med tanke på att gastric cancer cellinjer inte visar cell sammansättning denna teknik visar, har det nuvarande protokollet en fördel över alternativa scratch-såret testmetoderna. Denna metod har optimerats whereby enskiktslager kan vara etablerade från hela organoids eller från en enda cell avstängning från dissocierade organoids och guldpläterade med en basalmembranet matris eller kollagen-beläggning. Det övergripande målet med detta protokoll är att upprätta en organoid härrör gastric epitelial enskiktslager kulturer för en roman såret helande analys.
Det nuvarande protokollet Detaljer inrättandet av mänskliga – och mus-härledda gastric epitelial enskiktslager som kan användas för scratch-såret analyser. Protokollet är beroende av begreppet hemvist stem cell isolering från primära mänskliga (eller mus) vävnader och är en modifierad protokollet först publicerades av Schlaermann et al7. Vi har särskilt optimerad protokollet här för att upprätta en konfluenta och polariserade gastric epitelial enskiktslager som uttrycker …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var stött av NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 bevilja (YZ).
Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
Gastrin | Tocris | 3006 | |
EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
Fetal Bovine Serum | FBS | ||
OPTIMEM | Invitrogen | ||
0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
37 °C Water Bath | |||
Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
125 mL round bottom flask | |||
1 in (25 mm) stir bar | |||
Rubber Septa | |||
Sterile Gauze | |||
Stir Plate | |||
Ring Stand | |||
Ring Stand Clamps | |||
Sterile petri dish | |||
18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
Sterile Razor Blades | |||
Wide-tip tweezers | |||
Curved Hemostatic Forceps | |||
200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
Oxygen Tank with rubber hosing | |||
1 g D-Sorbitol | |||
Sucrose | Fisher | SS-500 | |
Dissecting microscope | |||
Dissecting Tray | |||
Rocking Table | |||
Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
Cell scraper | Corning | 353086 | |
Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
Razor blade | |||
L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |