방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Summary

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

Abstract

누가 살아남을 폐 렴 환자 병원 방전을 따르는 달에서 사망률 높은 있다. 그것은 폐 렴 중 폐 조직의 감염 이후의 끝 기관 실패를 이끌어 낼 수 있는 오래 된 cytotoxins의 생산에 결과 가설 되었습니다. 생체 외에서 분석 실험 폐 감염 시 cytotoxins 생산 가설 테스트를 개발 했습니다. 고립 된 쥐 폐 동맥 내 피 세포 및 박테리아 녹 농 균 모델 시스템으로 사용 되 고 cytoxins 내 피 세포의 감염 박테리아에 의해 다음의 생산 세포 배양 뒤를 사용 하 여 설명 된다 젖 산 효소 분석 실험 및 ImageJ 기술을 활용 하 여 새로운 미세한 메서드를 사용 하 여 직접 정량. 이러한 cytotoxins의 녹말 체 자연 및 immunoblotting 및 A11 안티 아 밀 로이드 항 체를 사용 하 여 immunodepletion thioflavin T 바인딩 분석 실험에 의해 입증 되었다. Immunoblotting를 사용 하 여 추가 분석 oligomeric 타우와 Aβ 생산 했 고 피 녹 농 균에 의해 감염에 따라 내 피 세포에 의해 발표는 설명 했다. 이러한 방법은 인간의 임상 샘플의 분석에 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

Introduction

폐 렴 생존 하는 환자의 병원 방전^1,을 따르는 달에서 사망률 높은^2,,34,,56. 대부분의 경우, 죽음은 치기^5,6뿐만 아니라 최종 기관 실패 신장, 폐, 심장, 또는 간 이벤트의 어떤 종류에 의해 발생 합니다. 이 환자 인구에 있는 높은 사망 율을 위한 이유는 결코 설립 되었습니다.

폐 렴으로 인수 되 고 중 커뮤니티-분류 또는 병원 인수 (nosocomial), 그리고 폐 렴을 일으킬 수 있는 에이전트 포함 박테리아, 바이러스, 버섯, 그리고 화학 제품. 병원내 폐 렴의 주요 원인 중 하나는 녹 농 균박테리아입니다. P. 농 균 exoenzymes 대상 셀^7,

Protocol

모든 동물 절차 검토 했다 기관 동물 관리 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학에 의해 승인 하 고 모든 연방, 주, 및 현지 규정에 따라 수행 했다. 쥐 폐 microvascular 내 피 세포 (PMVECs)의 기본 문화 폐 생물학의 사우스 알라바 마 대학의 센터에서 셀 문화 핵심 시설에서 얻은 했다. 셀 앞에서 설명한 절차¹⁶를 사용 하 여 준비 되었다.

1입니다. 세포 독성 Supernatants의 세대

참고: 여기, 우리가 피 녹 농 균의 두 가지 변종이 사용: PA103 그대로 유형 III 분 비 시스템이 감염, 및 ∆PcrV는 유형 III 분 비 체계 부족 하는 동안 대상 셀에 ExoU 및 ExoT exoenzymes를 전송할 수 있는 접종을 다음 대상 셀에 exoenzymes 전송의 능력이.

1. 보 글 보 너 (VB) 한 천 격판덮개¹⁷ 에 박테리아를 행진 하 고 37 ° c.에 하룻밤 성장
   1. 접시를 준비 하려면 확인 다음 재고 솔루션 (보 글 보 너 염; 10 x 주식): 2 세대 MgSO₄, 20 g 구 연산 (자유로운 산), 100....

Results

간단한 생체 외에서 시험 셀 박테리아 P. 녹 농 균감염의 supernatants에 cytotoxins의 존재에 대 한 분석 결과를 개발 되었습니다. 기본적으로, 감염 된 세포에서 배양 후 세균 또한 4 h 수집, 박테리아의 표면에 뜨는, 문화 살 균 필터에 의해 제거 되 고 살 균 상쾌한 셀의 새로운 인구에 추가 됩니다. 셀은 다음 상쾌한의 추가 후에 21-24 h를 관찰 하 고 셀 죽이 정량.

PMVECs의 confluent 레이어에 P. 녹 농 균 의 추가 셀 사이 간격의 형성을 유도합니다. Vivo에서, 갭 형성 폐부종과 폐 기능 감소에 지도 한다. 분석 결과 설명된에서 갭 형성은 사용 시간-포인트 심사에 대 한 셀 문화 supernatants PA103 가진 외피의 충분 한 기간으로 cyto.......

Discussion

여기 방법 간단한 체 외에 유기 체를 일으키는 폐 렴으로 감염 시 세포 독성 amyloids의 세대의 데모를 허용 하는 설명 되어 있습니다. 이러한 방법에는 세포 배양 세포 독성 분석 실험, immunoblotting, 소설 현미경 방법 및 ThT 바인딩을 사용 하 여 죽이 세포의 정량 포함 됩니다. 그들은 자연 (그림 2 및 그림 4)에서 아 밀 로이드 이며 전시 프리온¹²의 특성 세포 독성 대리인의 분석은 설명 했다. 폐 렴 중 세포 독성 프리온 분자의 세대에 그들의 병원 방전에 따라 폐 렴 생존자에서 높은 사망률에 대 한 잠재적인 설명을 제공 한다. 실험 진행 중에는이 가능성을 테스트 합니다.

기술된 연구의 모든 주요 이벤트의 세포 독성 상쾌한 세대 이며 두 가지 중요 한 변수.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
토끼 항 베타 아밀로이드	Thermo	71-5800
A11 아밀로이드 올리고머 항체	StressMarq	SPC-506D
T22 안티 타우 올리고머 항체	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 미크론 주사기 필터	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP 염소 안티 토끼 IgG	Abcam	ab6721-1
균주 PA103 및 Δ PcrV			녹농균의 이러한 균주는 Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC, Griffonia lectin,	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin,	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112	에서 수득하였다.
유형 2 콜라겐 분해 효소	Worthington	LS004176
Fetal 소 세럼	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
인산마그네슘 헵타하이드레이트	MP Biomedicals	MP021914221
구연산	G Biosciences	50-103-5801
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트	시그마	S9506-500G
백작 자동화 세포 계수기	Invitrogen	C10277