Fluorescens molekylære tomografi for In Vivo billeddannelse af glioblastom Xenografts
Summary
Orthotopic intrakraniel injektion af tumorceller har været anvendt i kræftforskning for at studere hjernen tumor biology, progression, evolution og terapeutisk respons. Her præsenterer vi fluorescens molekylære tomografi af tumor xenografts, der giver real-time intravital imaging og kvantificering af en tumor masse i prækliniske glioblastom modeller.
Abstract
Tumorigenisitetsforsøg er kræftceller evne til at danne en tumor masse. En udbredt tilgang til at afgøre, om cellerne er tumorfremkaldende er ved at indsprøjte immundefekte mus subkutant med kræftceller og måle tumor massen, når det bliver synlig og håndgribelig. Orthotopic injektioner af kræftceller har til formål at indføre xenograft i det mikromiljø, der mest ligner væv af oprindelsen af tumor undersøges. Hjernen kræftforskning kræver intrakraniel indsprøjtning af kræftceller til at tillade tumordannelse og analyse i den unikke mikromiljø i hjernen. I vivo billeddannelse af intrakranielle xenografts overvåger øjeblikkeligt tumor massen af orthotopically aflægger mus. Her rapporterer vi brugen af fluorescens molekylære tomografi (FMT) af hjernen tumor xenografts. Kræftcellerne er først transduced med nær infrarød fluorescerende proteiner og derefter injiceres i hjernen hos immunkompromitterede mus. Dyrene er derefter scannet for at få kvantitative oplysninger om tumor massen over en længere periode. Celle pre mærkning giver mulighed for omkostningseffektiv, reproducerbare og pålidelig kvantificering af tumor byrde inden for hver mus. Vi fjernede behovet for intravenøs imaging substrater, og således reduceret stress på dyrene. En begrænsning af denne tilgang er repræsenteret ved manglende evne til at detektere meget små masserne; Det har imidlertid bedre opløsning for større masse end andre teknikker. Det kan anvendes til at vurdere effekten af en behandling eller genetiske ændringer af gliom cellelinjer og patient-afledte prøver.
Introduction
Kræft er en af de førende årsager til sygdom-relaterede dødsfald blandt mennesker i den industrialiserede verden. Med en ekstremt høje dødstal er nye behandlinger tvingende nødvendigt. Glioblastom multiforme (GBM) er en ekstremt dødelige form for kræft i hjernen, sammensat af heterogene befolkninger af hjernen tumor, stromale og immun celler. Ifølge Central hjerne tumor registreringsdatabasen i USA er forekomsten af primære maligne og ikke-maligne hjernetumorer ca 22 tilfælde pr. 100.000. Ca 11.000 nye sager forventes at blive diagnosticeret i USA i 20171.
Prækliniske undersøgelser undersøge sandsynligheden for et stof, procedure eller behandling for at være effektiv inden prøvningen i mennesker. Et af de tidligste laboratorium skridt i prækliniske undersøgelser er at identificere potentielle molekylære mål for narkotikabehandling ved hjælp af kræftceller implanteret i en værtsorganisme, defineret som menneskelige xenograft modeller. I denne kontekst, har intrakraniel hjerne tumor xenograft modeller ved hjælp af patient-afledte xenografts (PDXs) været meget anvendt til at studere hjernen tumor biology, progression, evolution og terapeutiske reaktion, og for nylig for biomarkører udvikling, narkotika screening, og personlig medicin2,3,4.
En af de mest overkommelige og ikke-invasiv i vivo imaging metoder til at overvåge intrakranielle xenografts er bioluminescens imaging (BLI)5,6,7,8. Men nogle BLI begrænsninger omfatter substrat administration og tilgængelighed, enzym stabilitet, og lys dæmper og spredning under imaging erhvervelse9. Her rapporterer vi den infrarøde FMT som alternativ tænkelig metode til at overvåge prækliniske glioblastom modeller. I denne metode, signal erhvervelse og kvantificering af intracranially implanterede PDXs, udtrykker en nær-infrarødt fluorescerende protein iRFP72010,11 (herefter betegnet som FP720) eller turboFP635 (herefter benævnt som FP635), udføres med en FMT imaging system. Ved hjælp af FMT teknologi, overvåget orthotopic tumorer kan være i vivo før, under eller efter behandling, i en ikke-invasiv, substrat-fri og kvantitative måde for prækliniske observationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor xenografts har været flittigt brugt i kræftforskning og har udviklet en række veletablerede Billeddannende teknikker: BLI; magnetisk resonans imaging (MR); Positron emissions tomografi (PET), beregnet tomografi (CT); FMT. Hver af disse tilgange kommer med fordele og ulemper, men i sidste ende supplerer hinanden med typen af oplysningerne. En af de mest almindeligt anvendte i vivo imaging-teknologi er BLI5,6,7<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center for GBM-PDX neurospheres. Dette arbejde blev støttet af nederlag GBM forskning Collaborative, et datterselskab af National hjerne Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez blev støttet af en award fra den amerikanske hjerne Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca blev delvist støttet af en amerikansk-italienske Cancer Foundation postdoc research fellowship. Frank Furnari modtager løn og supplerende støtte fra Ludwig Institut for kræftforskning.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child’s Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A., Kozlov, S. V. . ATM Kinase: Methods and Protocols. , 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E., Badr, C. E. . Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. , 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
