Молекулярные томография флуоресценции для изображений в Vivo ксенотрасплантатов глиобластомы
Summary
Внутричерепных инъекций ортотопическая опухолевых клеток был использован в исследовании рака учиться биология опухоли мозга, прогрессии, эволюция и терапевтические реакции. Здесь мы представляем флуоресценции молекулярной томография ксенотрасплантатов опухоль, которая обеспечивает реального времени прижизненной визуализации и количественная оценка опухоль массы в доклинических глиобластома модели.
Abstract
Tumorigenicity — это возможность раковых клеток сформировать опухоль массы. Широко используется подход, чтобы определить, если клетки онкогенной — путем инъекций иммунодефицитных мышей подкожно с раковые клетки и измерения массы опухоли после того, как она становится видна и ощутима. Инъекции ортотопическая раковых клеток цель представить ксенотрансплантата в микроокружения, который наиболее близко напоминает ткани происхождения опухоли изучается. Исследования рака мозга требует внутричерепных инъекции раковых клеток, чтобы позволить образования опухоли и анализа в уникальных микроокружения мозга. В естественных условиях изображений внутричерепных ксенотрасплантатов контролирует мгновенно масса опухоли orthotopically прижившимися мышей. Здесь мы приводим использование флуоресценции молекулярной томография (ДРМ) ксенотрасплантатов опухоль мозга. Раковые клетки сначала преобразованы с вблизи инфракрасного флуоресцентных белков и затем вводят в головном мозге мышей, с ослабленным иммунитетом. Животные, затем сканируются для получения количественной информации о опухоль массы течение длительного периода времени. Клетки предварительно маркировки позволяет экономически эффективной, воспроизводимые и надежной количественной оценки бремени опухоли в пределах каждой мыши. Мы устранить необходимость для инъекций изображений субстраты и таким образом сократить нагрузку на животных. Ограничение этого подхода представляет невозможность обнаружения очень малых масс; Однако она имеет лучшее разрешение для больших масс, чем другие методы. Он может применяться для оценки эффективности лечения наркомании или генетические изменения линий клеток глиомы и пациент, полученных образцов.
Introduction
Рак является одной из ведущих причин смертей, связанных с болезнью, в людей в промышленно развитых странах. С чрезвычайно высокой погибших срочно необходимы новые методы лечения. Глиобластомы мультиформной (GBM) является чрезвычайно смертоносного тип рака мозга, состоящий из разнородных популяций мозга опухоль, стромы и иммунных клеток. Согласно реестра Центральный мозг опухоль из США частота первичных злокачественных и доброкачественных опухолей головного мозга составляет около 22 случаев на 100 000 живорождений. Ожидается, что примерно 11 000 новых случаев диагностируется в США в 2017 году1.
Доклинические исследования изучить вероятность наркотиков, процедуры или лечение эффективным до начала испытаний на людях. Одним из первых шагов лаборатории в доклинических исследованиях является идентификация потенциальных молекулярных целей на лечение с помощью раковые клетки, имплантированные в организме хозяина, определяется как человека ксенотрансплантата модели. В этом контексте внутричерепной мозга опухоль ксенотрансплантата модели с помощью пациент производные ксенотрасплантатов (PDXs) широко использовались для изучения биология опухоли мозга, прогрессии, эволюция и терапевтического ответа и совсем недавно для развития биомаркеров, наркотиков скрининг и персональной медицины2,3,4.
Один из наиболее доступных и неинвазивные в vivo imaging методы мониторинга внутричерепных ксенотрасплантатов является биолюминесценции изображений (BLI)5,6,,78. Однако некоторые ограничения BLI включают субстрата администрации и доступности, стабильность фермента, закалки и рассеяния во время визуализации приобретение9. Здесь мы приводим инфракрасный ДРМ как альтернативу визуализации метод мониторинга доклинические глиобластома модели. В этот метод, приобретение сигналов и количественной оценки интракраниально имплантированных PDXs, выражая ближней ИК-области флуоресцентный белок iRFP72010,11 (отныне называются FP720) или turboFP635 (отныне называются FP635), выполняется с ДРМ изображений системы. Используя технологию FMT, ортотопическая, опухоли могут быть мониторинг в естественных условиях до, во время или после лечения, неинвазивный, субстрат бесплатно и количественные образом для доклинических наблюдений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опухоль ксенотрасплантатов широко использовались в раковых исследований и разработан ряд устоявшихся методов обработки изображений: BLI; Магнитно-резонансная томография (МРТ); Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), компьютерная томография (КТ); ДРМ. Каждый из этих подходов поставляет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Фредерик Lang, MD Anderson Cancer Center для GBM-PDX-neurospheres. Эта работа была поддержана поражение GBM исследований совместное, филиал Национального мозга опухоль общества (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), Джеймс S. McDonnell фонд (Frank Furnari); Хорхе Бенитес был поддержан награду от Американской ассоциации опухоли мозга (ABTA); Ciro Zanca частично поддерживается докторантура стипендий американский-итальянский фонд рака. Фрэнк Furnari получает зарплату и дополнительную поддержку от Института Людвига для исследований рака.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child’s Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A., Kozlov, S. V. . ATM Kinase: Methods and Protocols. , 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E., Badr, C. E. . Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. , 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
