Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts
Summary
Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.
Abstract
Tumorigenicidade é a capacidade das células cancerosas para formar um tumor massa. É uma abordagem amplamente utilizada para determinar se as células forem oncogenicidade camundongos imunodeficientes a injectar por via subcutânea com células cancerosas e medindo a massa tumoral, depois torna-se visível e palpável. Ortotópico injeções de células de câncer visam introduzir o enxerto heterólogo no microambiente que mais se assemelha ao tecido de origem do tumor a ser estudada. Pesquisa de cancer do cérebro requer intracraniana injeção de células cancerosas para permitir a formação de tumor e análise no microambiente exclusivo do cérebro. A imagem na vivo de xenografts intracranianas monitora instantaneamente a massa tumoral de ratos orthotopically incorporada. Aqui nós relatamos o uso da fluorescência molecular tomografia computadorizada (FMT) de xenografts do tumor de cérebro. As células cancerosas são primeiro transfectadas com perto de infravermelhas proteínas fluorescentes e então injetadas no cérebro de ratos imunodeprimidos. Os animais são então digitalizados para obter informações quantitativas sobre a massa tumoral durante um período prolongado de tempo. Célula pré-rotulagem permite custo efetiva, reprodutível e confiável quantificação dos encargos tumor dentro de cada rato. Nós eliminou a necessidade de injeção de substratos de imagem e assim reduzir o stress dos animais. Uma limitação dessa abordagem é representada pela incapacidade de detectar massas muito pequenas; Entretanto, tem a melhor resolução para massas maiores do que outras técnicas. Pode ser aplicado para avaliar a eficácia de um tratamento medicamentoso ou alterações genéticas de linhas de células de glioma e amostras de paciente-derivado.
Introduction
Câncer é uma das principais causas de mortes relacionadas com a doença em seres humanos no mundo industrializado. Com um extremamente elevado número de mortes, novos tratamentos são urgentemente necessários. Glioblastoma multiforme (GBM) é um tipo extremamente letal de câncer no cérebro, composto de populações heterogêneas de células cerebrais tumor estromal e imune. De acordo com o registro de tumor cerebral Central dos EUA, a incidência de tumores cerebrais primários não-malignas e malignas é aproximadamente 22 casos por 100.000. Aproximadamente 11.000 novos casos são esperados para serem diagnosticados nos EUA em 20171.
Estudos pré-clínicos investigam a probabilidade de um medicamento, procedimento ou tratamento eficaz antes de serem testadas em seres humanos. Um dos primeiros passos laboratoriais em estudos pré-clínicos é identificar potenciais alvos moleculares para tratamento medicamentoso usando células cancerosas implantadas no organismo hospedeiro, definido como modelos de xenoenxertos humana. Dentro deste contexto, os modelos de enxerto de tumor cerebral intracraniana usando xenografts paciente-derivado (PDXs) têm sido amplamente utilizados para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica e mais recentemente para o desenvolvimento de biomarcadores, drogas triagem e personalizada medicina2,3,4.
Um dos mais acessíveis e não-invasivo na vivo por imagens métodos para monitorar xenografts intracranianas é bioluminescência de imagem (BLI)5,6,7,8. No entanto, algumas limitações BLI incluem administração de substrato e disponibilidade, estabilidade da enzima e luz têmpera e Dispersando durante aquisição9de imagem. Aqui nós relatamos o FMT infravermelho como uma alternativa de imagem método para monitorar modelos pré-clínicos glioblastoma. Neste método, a aquisição do sinal e quantificação de PDXs intracraniano implantados, expressando uma proteína fluorescente de infravermelho próximo iRFP72010,11 (doravante denominado como FP720) ou turboFP635 (doravante denominado como FP635), é executada com um sistema de imagem de FMT. Usando a tecnologia FMT, o ortotópico tumores podem ser monitorado na vivo antes, durante ou após o tratamento, de forma não-invasiva, livre de substrato e quantitativa para observações pré-clínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenografts tumor têm sido extensivamente usados em pesquisa de câncer e desenvolveu um número de técnicas de imagem bem estabelecidas: BLI; ressonância magnética (MRI); tomografia por emissão de positrões (PET), computado (CT); FMT. Cada uma dessas abordagens vem com prós e contras, mas no final se complementam com o tipo de informação fornecida. Um do mais comumente usado em vivo tecnologia de imagem é BLI5,6,7</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center para GBM-PDX neurospheres. Este trabalho foi apoiado pela derrota GBM pesquisa colaborativa, uma subsidiária da sociedade nacional de cérebro Tumor (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez foi apoiado por um prêmio de americana cérebro Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca foi parcialmente apoiado por uma bolsa de pesquisa postdoctoral do americano-italiano Cancer Foundation. Frank Furnari recebe salário e suporte adicional do Instituto Ludwig para pesquisa do câncer.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
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