Immunophenotyping के Orthotopic Homograft (Syngeneic) के Murine प्राथमिक KPC अग्नाशय वाहिनीई ग्रंथिकर्कटता द्वारा प्रवाह Cytometry
Summary
murine orthotopic PDAC homografts के immunophenotyping पर प्रयोगात्मक प्रक्रिया ट्यूमर इंयूनो-microenvironment की रूपरेखा पर करना है । ट्यूमर सर्जरी के जरिए प्रत्यारोपित orthotopically हैं. 200 के ट्यूमर – 600 मिमी आकार में3 काटा और एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए असंबद्ध थे, बहु प्रतिरक्षा मार्कर FACS विश्लेषण द्वारा अलग फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर के बाद.
Abstract
Homograft (syngeneic) ट्यूमर आज के इंयूनो-ऑन्कोलॉजी (आई. ओ.) के workhorse नैदानिक अनुसंधान कर रहे हैं । ट्यूमर microenvironment (टीएमई), विशेष रूप से अपनी प्रतिरक्षा घटकों, रोग का निदान और उपचार के परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन immunotherapy के । टीएमई प्रतिरक्षा-घटक बहु-रंग FACS द्वारा assessable ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट से बना रहे हैं. अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (PDAC) घातक अच्छे उपचार के विकल्प की कमी द्रोह के बीच है, इस प्रकार एक तत्काल और unmet चिकित्सा की जरूरत है । अपनी गैर विभिंन चिकित्सा के लिए जवाबदेही के लिए एक महत्वपूर्ण कारण (chemo-, लक्षित, मैं/ओ) अपने प्रचुर मात्रा में टीएमई, fibroblasts और ल्यूकोसाइट्स है कि इन उपचारों से ट्यूमर कोशिकाओं की रक्षा से मिलकर किया गया है । Orthotopically प्रत्यारोपित PDAC और अधिक सही पारंपरिक चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) मॉडल की तुलना में मानव अग्नाशय के कैंसर के टीएमई पर कब्जा करने के लिए माना जाता है ।
Homograft ट्यूमर (KPC) का प्रत्यारोपण कर रहे हैं माउस सहज PDAC से उद्भव अनुवांशिक इंजीनियर KPC-चूहों (KrasG12D/+/P५३-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). प्राथमिक ट्यूमर ऊतक छोटे टुकड़ों (~ 2 मिमी3) में कटौती और syngeneic प्राप्तकर्ताओं (C57BL/6, 7-9 सप्ताह पुरानी) के लिए (एससी) चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित है । homografts तो शल्य चिकित्सा orthotopically नए C57BL के अग्ंयाशय पर प्रत्यारोपित किया गया/6 चूहों, साथ अनुसूचित जाति-आरोपण, जो के ट्यूमर मात्रा तक पहुंच 300-1000 मिमी3 द्वारा 17 दिन । केवल 400 के ट्यूमर-600 मिमी3 अनुमोदित शव परीक्षण प्रक्रिया के अनुसार काटा गया और आसंन गैर ट्यूमर ऊतकों को दूर करने के लिए साफ किया । वे एक एकल सेल निलंबन में dissociator ऊतक का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रति असंबद्ध थे, फ्लोरोसेंट के निर्दिष्ट पैनलों के साथ धुंधला-अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिंन मार्करों के लिए लेबल एंटीबॉडी (लसीकावत्, माइलॉयड और NK, dc) के बाद । सना हुआ नमूनों बहु रंग FACS का उपयोग करने के लिए विभिन्न वंश की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया, साथ ही ट्यूमर के भीतर अपने रिश्तेदार प्रतिशत. orthotopic ट्यूमर की प्रतिरक्षा प्रोफाइल तो अनुसूचित जाति के ट्यूमर की तुलना में थे । प्रारंभिक डेटा अग्ंयाशय पर ट्यूमर में TILs/TAMs घुसपैठ में काफी ऊंचा प्रदर्शन किया, और एससी ट्यूमर के बजाय orthotopic में उच्च बी-सेल घुसपैठ ।
Introduction
अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (PDAC) लगभग साढ़े दस लाख मृत्युदर दुनिया चौड़ा प्रतिवर्ष, शीर्ष 5 कैंसर हत्यारों में से एक का कारण बनता है । वहां कुछ प्रभावी उपचार के विकल्प और कोई अनुमोदित immunotherapies हैं; इसलिए, नए उपचार की सख्त जरूरत है । कैंसर तेजी से आज ज्ञात के रूप में आनुवंशिक रोगों के अलावा, PDAC सहित प्रतिरक्षा रोगों के रूप में मांयता प्राप्त किया जा रहा है । प्रतिरक्षा और आनुवंशिक कारकों की संभावना रोग का निदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचार परिणामों का निर्धारण करेगा । ट्यूमर मेजबान प्रतिरक्षा निगरानी से बचने और अंततः मौत का कारण अग्रिम । इन प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के कई ट्यूमर microenvironment के भीतर होते हैं (टीएमई)1,2,3,4 जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत, एक दूसरे के साथ और अन्य ट्यूमर के साथ stromal अवयव, प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से साइटोकिंस जो अंततः रोग के परिणाम का निर्धारण । इसलिए, टीएमई, या ट्यूमर immunophenotyping के ट्यूमर प्रतिरक्षा घटकों के लक्षण वर्णन, उपलेखन सहित, numeration और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रजातियों के स्थानीयकरण, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. PDAC के मामले में, यह प्रस्तावित किया गया है कि ऊंचा ट्यूमर घुसपैठ दमन मैक्रोफेज (टैम) और बी कोशिकाओं टी सेल घुसपैठ और/या सक्रियण और फाइब्रोसिस5,6के उच्च स्तर की रोकथाम के लिए नेतृत्व किया है ।
प्रतिरक्षा TMEs की जांच करने के लिए आम दृष्टिकोण प्रयोग सरोगेट ट्यूमर नैदानिक पशु मॉडल का उपयोग किया जाएगा, मुख्य रूप से प्रासंगिक माउस ट्यूमर मॉडल7, विशेष रूप से माउस syngeneic (homograft) या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMM) कैंसर के, माउस और ट्यूमर और प्रतिरक्षा के लिए मानव के ग्रहण समानता पर8,9। यह वास्तविकता में समझा जाता है कि दो प्रजातियों के बीच निहित मतभेद हैं10,11.
प्रत्यारोपित माउस ट्यूमर सहज ट्यूमर7, अर्थात् सिंक्रनाइज़ ट्यूमर विकास, पैतृक GEMM सहज ट्यूमर विकास के विपरीत में महत्वपूर्ण परिचालन लाभ है । सहज murine ट्यूमर के Homografts प्राथमिक इन विट्रो मेंहेरफेर किया गया है कभी नहीं ट्यूमर माना जाता है, और मूल माउस ट्यूमर histo-/molecular पैथोलॉजी7, साथ ही संभव प्रतिरक्षा प्रोफाइल दर्पण । इन murine homografts को प्रायः “रोगी के एक माउस संस्करण-व्युत्पन्न xenografts (PDXs)” माना जाता है. वे इसलिए की संभावना पारंपरिक syngeneic सेल लाइन से एक बेहतर अनुवाद-प्राप्त माउस ट्यूमर12है । विशेष रूप से, कई homografts विशिष्ट GEMM से प्राप्त कर रहे हैं, जहां विशिष्ट मानव रोग तंत्र, उदाहरण के लिए oncogenic चालक उत्परिवर्तनों, इंजीनियर हैं, और इन homografts इसलिए उनके नैदानिक प्रासंगिकता के लिए लाभ होना चाहिए । विशेष रूप से, KPC GEMM 15 के भीतर माउस PDAC का विकास-उंर के 20 सप्ताह है, जो recapitulates अच्छी तरह से मामूली विभेदित predominately वास्तुकला और अत्यधिक समृद्ध ग्रंथियों के साथ मानव रोग आकृति विज्ञान स्ट्रोमा । यह मॉडल भी मानव PDAC की सबसे आम आनुवंशिक सुविधाओं recapitulates, अर्थात् उत्परिवर्तन और P53 नुकसान की-समारोह है, जो ९०% और मानव PDAC के ७५% में होते हैं, क्रमशः5,6सक्रिय Kras ।
प्रत्यारोपण की साइटों को भी मॉडल अनुवाद में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है । इस तरह के एक इसी orthotopic वातावरण के रूप में विशिष्ट आसपास के ऊतकों पर्यावरण, विशिष्ट ट्यूमर के लिए प्रगति के लिए एक जगह हो सकता है, के रूप में आमतौर पर प्रत्यारोपण ट्यूमर के लिए वर्दी चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) वातावरण का विरोध किया । यह विशेष ब्याज की होगी, और/या, क्या अंतर दो प्रत्यारोपण साइटों के बीच मौजूद है, प्रतिरक्षा-microenvironment के मामले में, और मानव कैंसर के लिए प्रासंगिकता, उदा। PDAC के मामले में ।
प्रतिरक्षा रूपरेखा, या immunophenotyping का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक, ट्यूमर का निर्धारण करने के लिए है, विभिन्न वंश की प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ, संख्या, ट्यूमर के भीतर सापेक्ष प्रतिशत, साथ ही उनके सक्रियण राज्यों, और स्थानों. यह ट्यूमर-infiltratrating lymphoctyes (TILs, दोनों टी और बी-), ट्यूमर घुसपैठ मैक्रोफेज (TAMs), ट्यूमर-प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (NKs) और ट्यूमर-निवासी वृक्ष कोशिकाओं3,13,14 घुसपैठ शामिल , 15 , 16 , 17, और कुछ कोशिकाओं के सेलुलर स्थानीयकरण18,19,20, आदि। प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) या प्रवाह cytometry एक एकल-कक्ष पहचान तकनीक है जो सामान्यतः किसी कक्ष के विशिष्ट पैरामीटर्स को मापने के लिए उपयोग की जाती है. बहु रंग प्रवाह cytometry एक एकल सेल3,4,21 पर कई मार्करों उपाय और संख्या और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट के सापेक्ष प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, ट्यूमर के भीतर उन सहित ।
इस रिपोर्ट में ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रूपरेखा के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: 1) orthotopic PDAC माउस ट्यूमर homografts के आरोपण, साथ अनुसूचित जाति आरोपण; 2) ट्यूमर ऊतक फसल और ट्यूमर पृथक्करण के माध्यम से एकल सेल तैयारी; 3) एक आधार रेखा के रूप में ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं के सभी का प्रवाह cytometry विश्लेषण; 4) दोनों ट्रांसप्लांटेशन दृष्टिकोण की आधारभूत प्रोफाइल की तुलना ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि अनुसूचित जाति ट्यूमर का उपयोग कर अध्ययन अधिक आसानी से आयोजित कर रहे हैं, orthotopically प्रत्यारोपित ट्यूमर मॉडल संभावित नैदानिक औषध विज्ञान अध्ययन के लिए अधिक प्रासंगिक हो सकता है (विशेष रूप से मैं/ इस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Dr. जोड़ी Barbeau शुक्रिया अदा करना चाहूंगा-महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि के संपादन के लिए, और कलाकृतियों को डिजाइन करने के लिए राल्फ मैनुअल धंयवाद । लेखक भी अपने महान तकनीकी प्रयासों के लिए, Vivo टीम में क्राउन विज्ञान ऑन्कोलॉजी इंयूनो-ऑन्कोलॉजी के मार्कर टीम और कैंसर विज्ञान का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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