Tilgængeligheden af somatiske SCs er afgørende for regenerativ medicin, sygdom modellering og få indsigt i SC egenskaber. Præsenterer her vi eksperimentelle strategier til at omprogrammere, in vitro, differentieret voksne celler ind i deres tilsvarende udvideligt væv-specifikke stem/stamceller af forbigående udtryk for den enkelt transcriptional Co aktivator YAP.
Her præsenterer vi protokoller for at isolere primære differentierede celler og drej dem i stem/stamceller (SCs) af samme slægt af forbigående udtryk for transskription faktor YAP. Med denne metode konverteres luminale differentieret (LD) celler i mælkekirtlen mus til celler, der udviser molekylære og funktionelle egenskaber af brystkirtler SCs. YAP også slår fuldt differentierede i bugspytkirtlen eksokrine celler i pancreas kanalen-lignende stamfaderen. På samme måde til endogen, naturlige SCs, kan YAP-induceret stilk-lignende celler (“ySCs”) i sidste ende udvides, som organoid kulturer lang sigt in vitro uden yderligere behov for ektopisk YAP/TAZ, som ySCs er udstyret med en arvelige selvstændig fornyelse SC-lignende tilstand.
Proceduren omprogrammering præsenteres her tilbyder muligheden for at generere og udvide in vitro- stamceller af forskellige væv kilder fra differentierede celler. Enkel udvidelse af somatiske celler ex vivo har konsekvenser for regenerativ medicin, for forståelse mekanismer af tumor indledning og generelt for celle og udviklingsmæssige biologi undersøgelser.
Væv-specifikke somatiske stamceller (SCs) er kritiske for fornyelse af væv og reparation efter skade. Mulighed for at nemt isolere og ubegrænset udvide ex vivo somatiske SCs repræsenterer et kritisk spørgsmål for potentielle regenerative behandlinger samt for SC applikationer i grundforskning og sygdom modellering. Fremskridt i denne retning, men har været begrænset af vanskeligheden ved at indfange SC staten af forskellige epitelial organer in vitro. Faktisk i flere voksen væv bosiddende SCs kan ikke findes eller ikke være let tilgængelige, eller deres antal og regenerativ potentiale kan blive udhulet af ældning eller sygdom forhold. I 2016, begyndte vi at udfylde dette hul ved at rapportere dette udtryk for en enkelt transcriptional coactivator, YAP (ja-forbundet protein) eller dens nært beslægtede proteiner TAZ (transcriptional activator med en PDZ motiv), i terminalt differentieret celler effektivt skaber funktionelle, kan udvides, ikke-tumorfremkaldende, autologe cellepopulationer, der er operationelt og molekylært skelnes fra deres tilsvarende væv-specifikke SCs1. En puls af vedvarende YAP eller TAZ aktivitet for få dage er tilstrækkelig til at fremkalde udseendet af selvstændig fornyelse somatiske SCs. Dette er en stabil tilstand, der er ikke længere afhængige af kontinuerlig transgen udtryk, som det kan overføres gennem celle generationer uden yderligere udtryk for ektopisk YAP/TAZ1. Protokollen præsenteres her detaljer proceduren, der bruges til at generere de novo epitelial stem/stamceller i mælkekirtlen og bugspytkirtel, startende fra differentierede celler i disse væv. Denne procedure fylder en sort boks i den nuværende omprogrammering/transdifferentiation arena. Vigtigste bestræbelser i disse retninger har faktisk indtil videre centreret på celle overgang til slutbrugeren inducerede pluripotente stamceller (iPSC), efterfulgt af konvertering af disse embryonale og pluripotente SCs i mere differentierede celler. IPSCs er dog tumorfremkaldende en gang indført i voksent væv, at øge behovet for at udvikle protokoller til deres fuldstændige og effektive differentiering2. Men denne differentiering skridt, selv når det er muligt, kommer til en pris af langsigtede udvidelsesmuligheder, selvorganisering og orgel genindsættelse potentialer. Disse er væsentlige attributter for orgel regeneration, der er faktisk typisk kun af endogene væv-specifikke SCs og af de i øjeblikket beskrevet YAP-induceret SCs (ySCs). Ligeledes differentierede direkte transdifferentiation i én celletype til en anden ved hjælp af cocktails af forskellige transskription faktorer også generere celler, der mangler væsentlige proliferativ og stemness potentielle3.
Proceduren beskrevet her også udnytter den nyligt indførte organoid teknologi, hvorved endogene SCs kan udvides og differentieret ex vivo4. YAP-induceret SCs kan generere organoid-dannende SCs selv i eksperimentel, biologiske eller sygdom betingelser hvor endogene SCs ikke er til stede. Vi vil gerne bemærke, at typen celle plasticitet formidles af YAP på forskellen med andre omprogrammering procedurer, kan svare til den eneste form for tilbagevenden til et SC-lignende status, der opstår i levende væv. Genfangst af SC-lignende træk har været forbundet med væv reparation eller muterede aktivering5. Selvom undværes for homeostase af flere voksen væv, er YAP og/eller TAZ absolut afgørende for regenerering, tumorvækst og ekspansion af somatiske SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Her præsenterer vi protokoller for at omprogrammere ex vivo terminalt differentieret epitelceller af forskellige væv ind i deres tilsvarende væv-specifikke stamceller (eller ySCs) ved forbigående ekspression af YAP, som rapporteret tidligere1. Vi har detaljerede to procedurer: en giver mulighed for omprogrammering af FACS-renset celler gennem lentiviral vektorer og en anden en, der undgår viral infektion og drager fordel af transgene YAP udtryk. Hver protokol præsenterer en effektiv strategi til at isolere og kultur primære differentierede celler og en strategi til at tvinge eksogene YAP genekspression i differentierede celler, generere de novo somatiske væv-specifikke udvides stamceller (jf. ordninger i figurer 1A og 2A).
Vi viste, at isolation strategier her præsenteret effektivt isolerer en ren population af differentierede celler, som det fremgår af det faktum, at vi aldrig fundet nogen udvækst fra negative kontrolprøver (tal 1 c og 2 C).
De lentiviral vektorer bruges i denne undersøgelse for omprogrammering af primære brystkirtler LD celler er doxycyclin inducerbar, tilbyder muligheden for en stram kontrol af transgenet udtryk; Dette giver mulighed for at tænde og slukke eksogene YAP udtryk på vil. Særlig opmærksomhed bør placeres i at undgå brugen af en overdreven viral titer, som dette kan være til skade for omprogrammering effektivitet. I tilfælde af primær acinar celler skiftede vi til en fuldt transgene tilgang til at opnå en YAP-afhængige omprogrammering med minimal manipulationer. Denne sidstnævnte strategi er også yderst velegnede til primær Pancreas acini, som isolerede acinar klynger er næppe imødekommenhed over for lentiviral infektion og meget skrøbelig. Den transgene strategi ansat tilbyder den samme fordel af doxycyclin-afhængige lentiviral vektorer for stram kontrol af genekspression. Desuden, den transgene strategi udnyttes med primære pancreas acini bærer den yderligere fordel af en meget højere omprogrammering effektivitet i forhold til viral-induceret omprogrammering af brystkirtler LD celler. Ud over de forskellige iboende plasticitet forbundet til celler, der stammer fra forskellige væv, kan den højere sats af pancreas omprogrammering være afledt fra den højere effektivitet af udtryk i forbindelse til ensartet og autonome YAP udtryk i alle eksplanterede celler. Især, har vi vist, at eksogene YAP er ikke længere nødvendig efter generation af ySCs (yMaSC kolonier og yDucts), uden at det påvirker deres selvfornyelse kapacitet. Dette er fordi ySCs genaktivere endogene YAP/TAZ og bruge dem til selvfornyelse, når eksogene YAP er slukket1.
Vi valideret forestillingen om, at ySCs faktisk opstå fra differentierede celler ved at kontrollere cellen i oprindelsen af vores omprogrammering eksperimenter gennem genetiske afstamning sporingen valideringer1.
Omfattende karakteriseringaf ySCs viser at YAP-induceret omprogrammering genererer normale somatiske SCs1 som jeg) på niveauet transkriptom ySCs vise massive overlapninger med indfødte SCs; II) ySCs vise differentiering potentielle og kan generere en multilineage afkom altid begrænset til identiteten af deres væv af oprindelse; III) ySCs er ikke-transformeret og ikke-tumorfremkaldende når transplanterede i vivo.
Her vi også beskrive procedurer for at opretholde og udvide i kultur både yMaSCs og yDucts som organoids indlejret i 100% basalmembranen matrix hydrogels. Disse betingelser giver mulighed for selv-organisering af ySCs i tre-dimensionelle organoids, der sikrer opretholdelsen af stemness egenskaber langsigtede i kultur, gør det muligt at udvide disse stamceller befolkninger på viljen til downstream analyser og applikationer. Af ukendte årsager, kunne vi ikke få yMaSC organoids ved at placere inficeret LD celler direkte i organoid kultur betingelser 7 dage efter doxycyclin behandling i plast vævskultur plade; med andre ord, er det mellemliggende vækst skridt i Brystkirtlerne koloni betingelser afgørende. I vores hænder kræver selv indfødte MaSCs brystkirtler koloni betingelser før passaging i organoid kultur. Desuden opnås den mest effektive organoid udvækst når vi undgå skaber de primære kolonier i enkelt celler, men snarere overføre de intakte kolonier i organoid kultur betingelser.
Organoid kultur betingelser også bærer fordel af at give mulighed for at cryopreserve ySCs, forudsat at organoids inddrives fra deres matricer, undgå celle dissociation før kryopræservering i kvælstof bad.
YAP omprogrammering procedure præsenteret kan konvertere forskellige differentieret celletyper stammer fra forskellige voksen væv i deres tilsvarende væv-specifikke stamceller (vi har testet den ved hjælp af brystkirtler, pancreas og neuronale celler)1. Til forskel fra iPSCs eller andre omprogrammering bestræbelser, kan YAP/induceret SCs bevare minderne om deres væv af oprindelse. Bemærk, nedtrapning differentiering af somatiske celler i cellerne begavet med stilk-lignende egenskaber er den eneste form for celle skæbne plasticitet og omprogrammering observeret in vivo, for eksempel efter vævsskader og understøtter sårheling5,17 , 18 , 19 , 20. det er bemærkelsesværdigt, at BJÆFFE og TAZ er i vid udstrækning undværes for normal homøostase, men afgørende for væv reparation i flere væv11,21. Konsekvent med en fysiologisk funktion af omprogrammering trin her beskrevet, har YAP/TAZ for nylig vist sig at være påkrævet i tarm regenerering i musemodeller af colitis ulcerosa patienter ved at forårsage en konvertering af voksne intestinale celler i en reparation epitel, der viser funktionerne i føtal gut19. YAP omprogrammering således udvider de nuværende induceret celle plasticitet strategier ved at give et middel til at generere somatiske stamceller, en stat, der har hidtil udfordrende for at fange in vitro. Denne fremgangsmåde, hvis udvides også til menneske-afledte celler, måske har bred relevans fra regenerativ medicin programmer til studiet af den somatiske stemness tilstand og til udbygning af somatiske stamceller celler in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker F. Camargo for gaven af Millie-YAPS127A mus; R26-rtTAM2 mus (stock #006965) blev købt fra The Jackson laboratorium. Vi takker Chiara Frasson og Giuseppe Basso hjælp til FACS procedurer. Dette arbejde støttes af AIRC særlige Program molekylære klinisk onkologi ” 5 promille ” og en AIRC PI-tilskud til Pia og ved Epigenetik flagskibsprojekt CNR-Miur tildeler S.P. Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale DENOVOSTEM nr. 670126).
10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
BPE | Gibco | 13028014 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dispase | Gibco | 1705-041 | |
Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
DnaseI | Roche | 11284932001 | |
doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
FBS | Gibco | 10270106 | |
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
HBSS | Gibco | 24020117 | |
HCl | Sigma | 30721 | |
heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
ITS-X | Gibco | 51500056 | |
K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
Waymouth medium | Gibco | 31220023 |