Tilgjengeligheten av somatiske SCs er avgjørende for regenerativ medisin, sykdom modellering og få innsikt i SC egenskaper. Presenterer her vi eksperimentelle strategier for å omprogrammere, i vitro, atskilte voksen celler til sine tilsvarende utvides vev-spesifikke stem/stamfar celler av forbigående uttrykk for enkelt transcriptional co aktivatoren YAP.
Her presenterer vi for å isolere primære differensierte celler og slå dem i stammen/stamfar celler (SCs) av den samme linjen av forbigående uttrykk av transkripsjon faktor YAP. Med denne metoden konverteres luminal differentiated (LD) celler i melkekjertlene musen til cellene som viser molekylære og funksjonelle egenskaper mammary SCs. YAP også blir fullt differensiert bukspyttkjertelen exocrine cellene i bukspyttkjertelen duct-lignende progenitors. Tilsvarende til endogene, naturlig SCs, kan YAP-indusert stilk-lignende celler (“ySCs”) til slutt utvides som organoid kulturer langsiktig i vitro, uten ytterligere behov for ektopisk YAP/TAZ, som ySCs er utstyrt med en arvelig selv fornyende SC-lignende tilstand.
Reprogramming prosedyren presenteres her tilbyr muligheten til å generere og utvide i vitro progenitor celler av ulike vev kilder fra differensierte celler. Enkel utvidelse av somatiske celler ex vivo har implikasjoner for regenerativ medisin, forståelse mekanismer av svulsten og, mer generelt, for celle og utviklingsbiologi studier.
Vev-spesifikke somatiske stamceller (SCs) er avgjørende for vev fornyelse og reparasjon etter skader. Muligheten til å enkelt isolere og unlimitedly utvide ex vivo somatiske SCs representerer et kritisk problem for potensielle regenerativ Therapy og SC programmer i grunnforskning og sykdom modellering. Fremgang i denne retningen, har imidlertid vært begrenset av vanskelighetene med å fange SC delstaten ulike epithelial organer i vitro. Faktisk i flere voksen vev bosatt SCs kan finnes ikke, eller ikke være lett tilgjengelig eller deres antall og regenererende potensial kan bli erodert av aldring eller sykdom forhold. I 2016, begynte vi å fylle dette gapet ved rapportering som uttrykk for en enkelt transcriptional coactivator, YAP (ja-assosiert protein) eller dens nært beslektede protein TAZ (transcriptional aktivator med en PDZ motiv), i terminalt differensierte celler effektivt skaper funksjonelle, utvidbare, ikke-tumorigenic, autologous celle populasjoner som er operativt og molecularly utvisket fra deres tilsvarende vev-spesifikke SCs1. En puls av vedvarende YAP eller TAZ dagene er tilstrekkelig til å indusere utseendet til selvstendig fornye somatiske SCs. Dette er en stabil tilstand som er ikke lenger avhengig av kontinuerlig transgene uttrykk, som det kan overføres gjennom cellen generasjoner uten videre uttrykk for ektopisk YAP/TAZ1. Protokollen presenteres her detaljer prosedyren brukes til å generere de novo epithelial stammen/stamfar celler melkekjertlene og bukspyttkjertelen, fra differensierte celler av disse vev. Denne prosedyren fyller en svart boks i gjeldende omprogrammering/transdifferentiation arena. Største innsats i disse retningene har faktisk så langt sentrert på cellen overgang til en indusert pluripotent stamceller (iPSC) tilstand, etterfulgt av konvertering av disse embryonale og pluripotent SCs i mer differensierte celler. Men er iPSCs tumorigenic en gang introdusert i voksen vev, øke behovet for å utvikle protokoller for deres fullstendig og effektiv differensiering2. Men kommer dette differensiering trinnet, selv når det er mulig, på prisen på langsiktige utvidelsesmuligheter, selv-organisering og orgel repopulation potensialer. Disse er viktige egenskaper for organ gjenfødelse som faktisk er typisk bare av endogene vev-spesifikke SCs og tiden beskrevet YAP-indusert SCs (ySCs). Tilsvarende differensierte direkte transdifferentiation av én celle type til en annen ved hjelp av cocktailer av ulike transkripsjon faktorer også generere celler som mangler essensielle proliferativ og stemness potensielle3.
Fremgangsmåten som er beskrevet her tar også nytte av den nylig introdusert organoid teknologien, som endogene SCs kan utvides og differensiert ex vivo4. YAP-indusert SCs kan generere organoid-forming SCs selv i eksperimentell, biologiske eller sykdom som endogene SCs ikke finnes. Vi ønsker å merke seg at forskjellen med andre reprogramming, type celle plastisitet formidles av YAP kan tilsvare den eneste formen for hjemfall til SC-lignende status som oppstår i levende vev. Reacquisition av SC-lignende trekk er tilknyttet tissue reparasjon eller kreftfremkallende aktivisering5. Selv om unnværlig for homeostase av flere voksen vev, er YAP og/eller TAZ helt avgjørende for regenerasjon, tumor vekst og ekspansjon av somatiske SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Her presenterer vi for å omprogrammere ex vivo terminalt differensiert epitelceller av ulike vev i sine tilsvarende vev-spesifikke progenitor celler (eller ySCs) av forbigående uttrykk for YAP, som rapportert tidligere1. Vi har detaljerte fremgangsmåter: en slik at omprogrammering av FACS-renset celler gjennom lentiviral vektorer og en ny en som unngår viral infeksjon og tar nytte av transgene YAP uttrykk. Hver protokoll presenterer en effektiv strategi for å isolere og kultur primære differensierte celler og en strategi for å fremtvinge eksogene YAP genuttrykk i differensierte celler, genererer de novo somatiske vev-spesifikke utvides stilk celler (se skjemaer i tallene 1A og 2A).
Vi viste at isolasjon strategier her presentert effektivt isolere en ren befolkning av differensierte celler, som demonstrert av det faktum at vi aldri oppdaget noen utvekst fra negativ kontroll prøver (tall 1 c og 2 C).
Lentiviral vektorer brukt i denne studien omprogrammere primære mammary LD celler, er doxycycline induserbart, tilbyr muligheten for en stram kontroll av transgene uttrykket; Dette gjør det mulig for å slå på og av eksogene YAP uttrykk på vil. Spesiell oppmerksomhet bør plasseres unngå bruk av en overdreven viral titer, så dette kan være skadelig tanke reprogramming effektivitet. Ved primær acinar celler byttet vi til en fullt transgene tilnærming for å få en YAP-avhengige omprogrammering med minimal manipulasjoner. Denne siste strategien er også spesielt egnet for primære bukspyttkjertelen acini, isolert acinar klynger er neppe mottakelig for lentiviral infeksjon og svært skjøre. Transgene strategi ansatt tilbyr samme fordelen av doxycycline-avhengige lentiviral vektorer for tett kontroll av genuttrykk. Videre bærer transgene strategien utnyttes med primære bukspyttkjertelen acini fordelen av en mye høyere reprogramming effektivitet sammenlignet den viral-indusert omprogrammering mammary LD celler. Utover de ulike iboende plastisitet knyttet til cellene stammer fra forskjellige vev, kan høyere frekvensen av bukspyttkjertelen omprogrammering utledes fra høyere effektiviteten av uttrykk forbundet til uniform og autonome YAP uttrykk i alle explanted celler. Spesielt, har vi vist at eksogene YAP er ikke lenger nødvendig etter generasjon av ySCs (yMaSC kolonier og yDucts), uten at det påvirker deres selvtillit fornyelse kapasitet. Dette er fordi ySCs reaktivere endogene YAP/TAZ og bruke dem for selvtillit fornyelse når eksogene YAP slås av1.
Vi validert forestillingen om at ySCs faktisk kommer fra differensierte celler ved å kontrollere cellen av opprinnelsen til våre reprogramming eksperimenter gjennom genetisk avstamning-sporing valideringer1.
Omfattende karakteriseringySCs viser at YAP-indusert omprogrammering genererer normal somatiske SCs1 som jeg) på transcriptomic nivå, ySCs vise massiv overlapper med innfødte SCs; II) ySCs vise differensiering potensielle og kan generere en multilineage avkom alltid begrenset til identiteten til deres vev av opprinnelse; III) ikke-tumorigenic når transplantert i vivoySCs er ikke forvandlet.
Her beskriver vi også prosedyrer for å opprettholde og utvide i kultur både yMaSCs og yDucts som organoids innebygd i 100% kjelleren membran matrise hydrogels. Disse forholdene tillater for selv-organisering av ySCs i tredimensjonale organoids som sikrer opprettholdelse av stemness egenskaper langsiktig i kultur, slik at å utvide dette stammer bestander på vilje for nedstrøms analyser og programmer. For ukjente årsaker vi kunne yMaSC organoids ved å plassere infisert LD celler direkte i organoid oppdrettsforholdene 7 dager etter doxycycline behandling i plast vev kultur plate; med andre ord, er det mellomliggende vekst trinnet i mammary kolonien forhold viktig. I våre hender krever enda innfødte MaSCs mammary kolonien betingelser før passaging i organoid kultur. Videre oppnås mest effektive organoid resultatet når vi unngå dissociating primære koloniene i enkeltceller, men heller overføre intakt koloniene i organoid kultur forhold.
Organoid oppdrettsforholdene bærer også fordelen av å gi muligheten til å cryopreserve ySCs, forutsatt at organoids gjenopprettes fra deres matriser, unngå celle dissosiasjon før kryonisk bevaring i nitrogen bad.
YAP omprogrammering prosedyren presentert kan konvertere distinkt forskjellige celletyper avledet fra forskjellige voksen vev til deres tilsvarende vev-spesifikke stamceller (vi har testet den med cellene mammary, bukspyttkjertelen og neuronal)1. Til forskjell fra iPSCs eller andre reprogramming innsats, kan YAP/indusert SCs opprettholde minnene om deres vev av opprinnelse. Av notatet, de differensiering av somatiske celler i celler med stilk-lignende egenskaper er den eneste formen for celle skjebne plastisitet og omprogrammere observert i vivo, for eksempel etter vevsskade, og å støtte sårheling5,17 , 18 , 19 , 20. det er bemerkelsesverdig at YAP og TAZ er hovedsakelig unnværlig for normal homeostase, men avgjørende for reparasjon av vev i flere vev11,21. Konsekvent med en fysiologisk funksjon av reprogramming trinnene som beskrives her, vist YAP/TAZ nylig seg å være nødvendig i intestinal gjenfødelse musen modeller pasienter med ulcerøs kolitt ved å få en konvertering av voksen intestinal celler i en reparasjon epitel som viser funksjonene i fosterets gut19. YAP omprogrammering dermed utvider gjeldende indusert celle plastisitet strategier ved å gi et middel til å generere somatiske stamceller, en stat som har vært så langt utfordrende for å fange i vitro. Denne kan hvis utvidet også til menneske-avledet celler, ha bred relevans fra regenerativ medisin programmer til studiet av somatisk stemness og for utvidelse av somatiske stilk celler i vitro.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker F. Camargo for gave Tejo-YAPS127A mus; R26-rtTAM2 mus (stock #006965) ble kjøpt fra Jackson laboratoriet. Vi takker Chiara Frasson og Giuseppe Basso hjelpen FACS prosedyrer. Dette arbeidet er støttet av AIRC spesielle Program molekylær Clinical Oncology ” 5 promille ” og en AIRC PI-Grant S.P, og Epigenetics flaggskip prosjektet CNR-Miur gir S.P. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjonsprogram (gi avtalen DENOVOSTEM nr. 670126).
10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
BPE | Gibco | 13028014 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dispase | Gibco | 1705-041 | |
Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
DnaseI | Roche | 11284932001 | |
doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
FBS | Gibco | 10270106 | |
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
HBSS | Gibco | 24020117 | |
HCl | Sigma | 30721 | |
heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
ITS-X | Gibco | 51500056 | |
K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
Waymouth medium | Gibco | 31220023 |