Preparat och protokoll för hela cellen Patch Clamp inspelningen av Xenopus laevis Tectal nervceller
Summary
I detta papper diskuterar vi tre hjärnan preparat som används för inspelning av hela cellen patch clamp för att studera retinotectal kretsen i Xenopus laevis grodyngel. Varje beredning, med sina särskilda fördelar, bidrar till den experimentella tractability av den Xenopus grodyngel som en modell för att studera neural krets funktion.
Abstract
Xenopus grodyngel retinotectal kretsen, består av de retinala ganglioncellerna (RGCs) i ögat som bildar synapser direkt på nervceller i den fiberoptiska tectum, är en populär modell att studera hur neurala kretsar själv montera. Förmågan att utföra hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller och att registrera RGC-framkallat svar, antingen i vivo eller använda en hela hjärnan beredning, har genererat ett stort antal högupplösta data om mekanismerna bakom normala , och onormal, krets bildning och funktion. Beskriver här vi hur du utför i vivo preparatet, ursprungliga hela hjärnan beredning, och en mer nyligen utvecklat övergripande hjärnan slice inför att erhålla hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller. Varje beredning har unika experimentella fördelar. I vivo preparatet möjliggör inspelning av direkta svar på tectal nervceller visuella stimuli projiceras på ögat. Hela hjärnan preparatet tillåter RGC axoner aktiveras på ett mycket kontrollerat sätt, och horisontella hjärnan slice preparatet tillåter inspelning från över alla lager av tectum.
Introduction
Retinotectal kretsen är den största komponenten i amfibie visuella systemet. Det består av en RGCs i ögat, som skjuter ut sina axoner till den fiberoptiska tectum där de bildar synapsförbindelser med postsynaptiska tectal nervceller. Xenopus grodyngel retinotectal kretsen är en populär utvecklingsmässiga modell att studera neural krets bildning och funktion. I området i närheten finns det många attribut av denna grodyngel retinotectal krets som gör det en kraftfull experimentell modell1,2,3. Ett större attribut, och i fokus för denna artikel, är förmågan att utföra hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller, i vivo eller använda hela hjärnan förberedelse. Med ett elektrofysiologi rigg utrustad med en förstärkare som stöder spänning – och ström-clamp inspelningslägena, tillåter hela cellen patch clamp inspelningar en neuron elektrofysiologi att präglas i hög upplösning. Som ett resultat, har hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller över de viktigaste skeendena i retinotectal krets bildandet lämnat en detaljerad och omfattande förståelse av utvecklingen och plasticitet av inneboende4,5 , 6 , 7 och synaptic8,9,10,11 boenden. Kombinera hela cellen patch clamp tectal neuron inspelningar, förmågan att uttrycka gener eller morpholinos av intresse i dessa nervceller12, och en metod att bedöma visuella guidade beteende via en etablerad visuella undvikande test13 främjar den identifiering av länkar mellan molekyler, krets funktion och beteende.
Det är viktigt att notera att typ av högupplösta data förvärvas från hela cellen patch clamp inspelningar inte är möjligt med nyare bildgivande metoder såsom indikatorn genetiska kalcium GCaMP6, eftersom även om använda kalcium indikatorer tillåter bildtagning av kalcium dynamics över stora populationer av nervceller samtidigt, finns det ingen direkt eller uppenbara sättet att de specifika elektriska parametrarna kan erhållas genom att mäta delta fluorescens i somata, och det finns inget sätt att spänning klämma neuron att mäta ström-spänning relationer. Tydligt dessa två distinkta tillvägagångssätt, elektrofysiologiska inspelningar och kalcium imaging, äger icke-överlappande styrkor och skapa olika typer av data. Således beror det bästa tillvägagångssättet på den specifika experimentella frågan behandlas.
Här beskriver vi vår metod för att förvärva hela cellen patch clamp inspelningar från nervceller i den grodyngel fiberoptiska tectum använder en i vivo förberedelse, hela hjärnan förberedelse, och en nyare ändrades hela hjärnan förberedelse som utvecklades i vårt labb14 . I avsnittet representativa resultat visar vi experimentella fördelarna med varje beredning och olika typer av data som kan erhållas. Gränser och styrkor av olika preparat, samt tips för felsökning, ingår i diskussionsavsnittet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alla metoder som beskrivs i detta arbete är optimerade för inspelning tectal nervceller från grodyngel mellan utvecklingsstadiet 42 och 49 (iscensatt enligt Neiuwkoop och Faber15). Av etapp 42, grodyngel är tillräckligt stor och tillräckligt utvecklad så att insekt stiften kan placeras på vardera sidan av hjärnan för in vivo -inspelningar och för att genomföra hela hjärnan dissektion. I tidigare stadier, när grodyngel är i huvudsak tvådimensionella (dvs, platta), …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöds av NIH bidraget SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
