Præparater og protokoller for hele cellen Patch klemme optagelsen af Xenopus laevis Tectal neuroner
Summary
I dette papir diskuterer vi tre hjernen præparater bruges til optagelse af hele cellen patch klemme til at studere retinotectal kredsløb af Xenopus laevis haletudser. Hvert præparat, med sin egen specifikke fordele, bidrager til den eksperimentelle sporbarhed af Xenopus haletudse som en model til at studere neurale kredsløb funktion.
Abstract
Xenopus haletudse retinotectal banen, består af retinal ganglion celler (RGCs) i øjet som danner synapser direkte til neuroner i det optiske tectum, er en populær model til at studere hvordan neurale kredsløb selv samle. Evnen til at udføre hele celle patch klemme optagelser fra tectal neuroner og registrere RGC-fremkaldte svar, enten i vivo eller ved hjælp af en hele hjernen forberedelse, har genereret en stor krop af høj opløsning data om de underliggende normale mekanismer , og unormal, kredsløb dannelsen og funktionen. Vi beskrive her, hvordan man udfører i vivo forberedelse, den oprindelige hele hjernen forberedelse, og en mere nylig udviklet vandrette hjernen skive forberedelse for at opnå hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner. Hvert præparat har unikke eksperimentelle fordele. I vivo forberedelse giver mulighed for optagelse af tectal neuroner direkte reaktion på visuelle stimuli projiceret op på øjet. Hele hjernen forberedelse giver mulighed for RGC axoner skal aktiveres i et stærkt kontrolleret måde, og horisontale hjernen skive forberedelse giver mulighed for optagelse fra på tværs af alle lag af tectum.
Introduction
Retinotectal kredsløb er det vigtigste element i padde visuelle system. Det består af RGCs i øjet, som projektet deres axoner til det optiske tectum, hvor de danner synaptiske forbindelser med postsynaptiske tectal neuroner. Xenopus haletudse retinotectal kredsløb er en populær udviklingsmæssige model til at studere neurale kredsløb dannelsen og funktionen. Der er mange attributter af denne haletudse retinotectal kredsløb, der gør det en kraftfuld eksperimentel model1,2,3. Én stor attribut, og fokus i denne artikel, er evnen til at udføre hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner, in vivo eller ved hjælp af en hele hjernen forberedelse. Med et Elektrofysiologi rig outfitted med en forstærker, der understøtter spænding – og aktuelle-klemme optagelsestilstande, tillade hele cellen patch klemme optagelser en neuron Elektrofysiologi til karakteriseres i høj opløsning. Som følge heraf har hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner på tværs af de vigtigste faser af retinotectal kredsløb dannelse givet en detaljeret og omfattende forståelse af udviklingen og plasticitet af iboende4,5 , 6 , 7 og synaptic8,9,10,11 egenskaber. Ved at kombinere hele cellen patch klemme tectal neuron optagelser, evnen til at udtrykke gener eller morpholinos af interesse i disse neuroner12, og en metode til at vurdere visuel guidede adfærd via en etableret visuelle undgåelse test13 fremmer den identifikation af forbindelserne mellem molekyler, kredsløb funktion og adfærd.
Det er vigtigt at bemærke, at typen af høj opløsning data erhvervet fra hele cellen patch klemme optagelser ikke er muligt ved hjælp af nyere billeddiagnostiske tilgange såsom indikatoren genetiske calcium GCaMP6, fordi selv ved hjælp af calcium indikatorer tillader imaging af calcium dynamics på tværs af store populationer af neuroner samtidigt, der er ikke direkte eller indlysende måde at de specifikke elektriske parametre kan fås ved at måle delta fluorescens i somata, og der er ingen måde at spænding klemme neuron til at måle Aktuel spænding relationer. Klart disse to forskellige tilgange, elektrofysiologiske optagelser og calcium imaging, besidder ikke-overlappende styrker og generere forskellige typer af data. Den bedste fremgangsmåde afhænger således af det konkrete eksperimentelle spørgsmål bliver behandlet.
Her beskriver vi vores metode for at erhverve hele cellen patch klemme optagelser fra neuroner i haletudse optiske tectum ved hjælp af en i vivo forberedelse, hele hjernen forberedelse, og en nyere ændret hele hjernen forberedelse, der blev udviklet i vores lab14 . I afsnittet repræsentant resultater vise vi eksperimentelle fordelene ved hvert præparat og de forskellige typer af data, der kan opnås. Grænser og styrker af forskellige præparater, samt tips til fejlfinding, er inkluderet i afsnittet diskussion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle metoder, der beskrives i dette arbejde er optimeret til optagelse af tectal neuroner fra haletudser mellem udviklingsstadiet 42 og 49 (iscenesat ifølge Neiuwkoop og Faber15). Tidspunkt 42, haletudser er tilstrækkeligt stort og tilstrækkeligt udviklede så at insekt benene kan placeres på enten side af hjernen i vivo optagelser og udfører hele hjernen dissektion. På tidligere stadier, når haletudser er hovedsagelig todimensional (dvs.flade), metoderne beskrevet her er …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af NIH grant SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
