Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen
Summary
In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.
Abstract
Het Xenopus tadpole retinotectal circuit, bestaat uit de retinale peesknoopcellen (RGCs) in het oog welk formulier synapses rechtstreeks op de neuronen in de optische tectum, is een populair model om te bestuderen hoe neurale circuits zelf monteren. De mogelijkheid voor het uitvoeren van de gehele cel patch klem opnames van tectal neuronen en naar record regering van Cambodja-opgeroepen antwoorden, beide in vivo of met behulp van een hele hersenen voorbereiding, heeft geleid tot een grote hoeveelheid hoge-resolutie data over de mechanismen die ten grondslag liggen aan een normale , abnormale, circuit vorming en functie. Hier beschrijven we het uitvoeren van de in vivo voorbereiding, de oorspronkelijke hele hersenen voorbereiding, en een meer recent ontwikkelde horizontale hersenen segment voorbereiding voor het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames van tectal neuronen. Elk preparaat heeft unieke experimentele voordelen. De in vivo voorbereiding kan de opname van de directe reactie van de tectal neuronen op visuele stimuli geprojecteerd op het oog. De hele hersenen voorbereiding zorgt voor de axonen van de regering van Cambodja worden geactiveerd op een zeer gecontroleerde manier, en de horizontale hersenen segment voorbereiding staat opname uit over alle lagen van de tectum.
Introduction
Het retinotectal circuit is het belangrijke onderdeel van het visuele systeem van amfibieën. Het bestaat uit de RGCs in het oog, die hun axonen aan de optische tectum waar ze synaptic verbindingen met postsynaptisch tectal neuronen vormen uitsteken. Het Xenopus tadpole retinotectal circuit is een populaire developmental model neurale vorming en functie te gaan studeren. Er zijn vele kenmerken van de deze tadpole retinotectal circuit, waardoor zij een krachtige experimentele model1,2,3. Een belangrijke kenmerk, en de focus van dit artikel, is de mogelijkheid voor het uitvoeren van hele cel patch klem opnames vanaf tectal neuronen, in vivo of met behulp van de voorbereiding van een hele hersenen. Met een electrofysiologie tuig uitgerust met een versterker die ondersteuning biedt voor spanning – en stroom-clamp opnamefuncties, toestaan hele cel patch klem opnames van een neuron electrofysiologie te worden gekenmerkt op hoge resolutie. Dientengevolge, hebben hele cel patch klem opnames van tectal neuronen in de belangrijkste stadia van retinotectal circuit vorming verstrekt een gedetailleerde en uitgebreide kennis van de ontwikkeling en plasticiteit van intrinsieke4,5 , 6 , 7 en synaptische8,9,10,11 eigenschappen. Het combineren van hele cel patch klem tectal neuron opnamen, de mogelijkheid om uit te drukken van genen of morpholinos van belang in deze neuronen12, en een methode om te beoordelen van visuele rondleiding gedrag via een gevestigde visuele vermijden test13 bevordert de identificatie van de banden tussen moleculen, circuit functie, en gedrag.
Het is belangrijk op te merken dat het type van hoge resolutie, verkregen uit hele cel patch-clamp opnamen gegevens niet mogelijk met behulp van de nieuwere imaging benaderingen zoals de genetische calcium indicator GCaMP6, is omdat hoewel calcium indicatoren de beeldvorming toelaat van calcium dynamiek in grote populaties van neuronen tegelijkertijd, er is geen directe of voor de hand liggende manier waarop de specifieke elektrische parameters kunnen worden verkregen door het meten van delta fluorescentie in de waarin, en er geen manier om spanning is klem het neuron om te meten stroom-spanning-relaties. Duidelijk deze twee verschillende benaderingen, elektrofysiologische opnames en calcium imaging, niet-overlappende troeven bezitten en genereren van verschillende typen gegevens. De beste aanpak hangt dus af van de specifieke experimentele vraag aangepakt.
Hier beschrijven we onze werkwijze voor het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames van neuronen van de tadpole optic tectum met behulp van een in vivo voorbereiding, hele hersenen voorbereiding, en een nieuwere bewerkt hele hersenen voorbereiding die is ontwikkeld in ons lab14 . In de sectie vertegenwoordiger resultaten tonen we de experimentele voordelen van elk preparaat en de verschillende soorten gegevens die kan worden verkregen. De grenzen en de sterke punten van de verschillende preparaten, alsmede tips voor het oplossen van problemen, zijn opgenomen in de sectie discussie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle methoden die worden beschreven in dit werk zijn geoptimaliseerd voor het opnemen van de tectal neuronen van kikkervisjes tussen ontwikkelingsstadium 42 en 49 (geënsceneerd volgens Neiuwkoop en Faber15). Door stage 42, de kikkervisjes zijn groot genoeg en voldoende ontwikkeld, zodat de insecten pinnen aan weerszijden van de hersenen voor in vivo opnames en voor het uitvoeren van de gehele hersendissectie kunnen worden geplaatst. In eerdere stadia, wanneer de kikkervisjes in wezen twe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door de NIH-subsidie SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
