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방법 논문

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

9.2K 조회수

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DOI:

10.3791/57465

⸱

2018년 3월 15일

 ,  , 

이 논문에서

요약

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

초록

Xenopus 올챙이 retinotectal 회로, 어떤 형태로 광섬유 tectum에 신경에 직접 synapses 눈에서 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 구성 어떻게 신경 회로 공부 하는 인기 모델은 자기 조립. 전체 수행 하는 기능 패치 클램프 기록 중 vivo에서 기록 RGC 갖는 응답을 tectal 뉴런에서 셀 또는 전체 두뇌 준비를 사용 하 여 일반 기본 메커니즘에 대 한 고해상도 데이터의 큰 몸 생성 했다 비정상적인, 회로 형성 및 기능. 여기 우리가 준비 vivo에서 , 원래 뇌 준비를 수행 하는 방법을 설명 하 고 더 최근 개발 tectal 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 얻기 위해 수평 뇌 조각을 준비. 각 준비 독특한 실험 장점이 있습니다. Vivo에서 준비 tectal 신경의 눈에 투영 하는 시각적 자극에 직접 응답의 녹음 수 있습니다. 뇌 준비 매우 제어 방식에서 활성화 RGC 축 삭에 대 한 허용 하며 수평 두뇌 슬라이스 준비에서 녹음은 tectum의 모든 레이어에서

서론

Retinotectal 회로 양서류 비주얼 시스템의 주요 구성 요소. 그것은 광섬유 tectum postsynaptic tectal 신경 세포와 시 냅 스 연결을 형성 하는 어디에 그들의 축 삭을 프로젝트 눈에서 RGCs 구성 됩니다. Xenopus 올챙이 retinotectal 회로 신경 회로 형성 기능을 공부 하 고 인기 있는 개발 모델입니다. 그것은 강력한 실험 모델,12,3렌더링이 올챙이 retinotectal 회로의 많은 특성이 있습니다. 한 주요 특성, 그리고이 문서의 초점 tectal 신경, vivo에서 또는 뇌의 준비를 사용 하 여 전체 셀 패치 클램프 기록 수행 하는 기능입니다. 전압 및 전류 클램프 녹음 모드를 지원 하는 앰프와 복 전기 생리학 장비, 전체 셀 패치 클램프 기록 수 높은 해상도에서 특징에 뉴런의 전기 생리학. 그 결과, 전체 셀 패치 클램프 기록 retinotectal 회로 형성의 주요 단계에 걸쳐 tectal 뉴런에서 개발의 상세 하 고 포괄적인 이해 하 고 내장4,....

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 와이오밍 대학에 의해 승인 되었습니다. Electrophysiological 녹음을 포함 한 모든 절차는 실 온, 약 23 ° c.에서 실시 여기에 설명 된 모든 방법은 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다.

1. Vivo에서 준비

  1. 올챙이 anesthetize
    1. 0.01% 스 테 인 버그의 솔루션을 포함 하는 작은 페 트리 접시에는 올챙이 놓고 약 5 분 동안 MS-222.
      참고: MS-222 일명 "Tricaine"는 일반적인 물고기와 양서류 마 취. Tadpoles는 m m에서 스 테 인 버그의 솔루션에서 발생 하는: 0.067 4.9 HEPES 5.8 NaCl, KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O.
    2. 올챙이 깊이 anaesthetized (무응답과 이상 수영) 2 단계를 진행 하기 전에 확인 합니다.
    3. <....

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결과

빛 갖는 응답를 빛의 전체 필드 플래시 결과 응답 개별 tectal 뉴런(그림 4)에서 기록 하는 동안 망막에 예상 된다. 이 특정 프로토콜은 모두 빛 ("에" 응답) 켜기 한 다음 15 신경의 응답을 측정 하도록 설계 되어 나중 "에서 응답." 측정 하는 s Tectal 신경은 일반적으로 응답에 이따금 강력한 전시 (표시 여기에 기록 된 전압 클램프 모드, 신경으로 고정-60mV 측정 시 냅 스 전류 (그림 4B)). 어떤 한 뉴런에서 수신 시 냅 스 드라이브의 양은 자발적 시 냅 스 이벤트 (그림 4C) 기록 하 여 측정할 수 있습니다. 전류-전압 관계 (I-v 곡선)을 신경 점점 depolarized 전위를 스텝으로 .......

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토론

이 작품에서 설명 하는 모든 방법 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다. 무대 42는 tadpoles는 충분히 크고 충분히 개발 곤충 핀 vivo에서 녹음 한 뇌 해 부를 수행 하기 위한 뇌의 양쪽에 배치 될 수 있도록. 이전 단계에서는 tadpoles는 근본적으로 2 차원 (즉, 평면), 여기서 설명 하는 접근은 최적이 아닙니다.

용이성에 tectal 신경 수 액세스 하 고 전체 셀 구성에 기록으로 인해이 모델 회로가 되었습니다 어떻게 신경 회로 형태에 대 한 기본적인 발견에 대 한 온상-기능과 기능 하는 동안19를 형성 하는 동안. 여기 우리가 전체 셀 패치 클램프 기록 vivo에서 올챙이 뇌 준비, 다른 녹음 구성, 및 데이터의 다른 유형의 .......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

NIH 그랜트 SBC COBRE 1P20GM121310-01에 의해 지원.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Stemi 스테레오 508Zeiss495009-0006-000 해부 현미경
MS-222 "Tricane"FinquelARF5G양서류 전신 마취
염화나트륨 (NaCl)Fisher ScientificS271-3Stienberg의 용액 및 외부 용액
염화칼륨 (KCl)Fisher ScientificP217-500Stienberg의 용액 및 외부 용액을 준비하는 데 사용
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGStienberg의 용액 및 외부 용액을 준비하는 데 사용
질산 칼슘 테트라 히레이트 (Ca (NO 3 < / sub>) • 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GStienberg의 솔루션을 준비하는 데 사용됩니다   
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Steinberg의 용액
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500G외부 기록 용액을 제조하는 데 사용
염화마그네슘 (MgCl2)J.T. Baker2444-01외부 기록 용액을 제조하는 데 사용
D-glucose 무수Mallinckrodt Chemicals6066-04외부 기록 용액
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 길항제
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제 을 준비하는 데 사용 를 제조하는 데 사용 . 유연한 컴퓨터

참고문헌

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu....

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