Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis
Summary
In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.
Abstract
Il circuito di retinotectal girino di Xenopus , comprende le cellule retiniche del ganglio (RGCs) nell’occhio che formano le sinapsi direttamente sui neuroni nel tectum ottica, è un modello popolare di studiare circuiti neurali come auto-assemblarsi. La capacità di svolgere tutta la cella le registrazioni del morsetto di patch da neuroni tectal e per registrare le risposte evocate RGC, entrambi in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello, ha generato un grande corpo dei dati ad alta risoluzione circa i meccanismi di fondo normale e anormale, circuito formazione e funzione. Qui descriviamo come eseguire la preparazione in vivo , la preparazione originale di tutto il cervello, e più recentemente sviluppato preparazione di fetta di cervello orizzontale per ottenere le registrazioni a cellula intera patch clamp da neuroni tectal. Ogni preparazione ha vantaggi unici sperimentali. La preparazione in vivo permette di registrare la risposta diretta dei neuroni tectal agli stimoli visivi proiettato sull’occhio. Permette la preparazione di tutto il cervello per gli assoni RGC deve essere attivata in modo altamente controllato, e la preparazione di fetta di cervello orizzontale permette la registrazione da attraverso tutti gli strati del tectum.
Introduction
Il circuito di retinotectal è il componente principale del sistema visivo anfibio. Si compone di RGCs nell’occhio, che proiettano i loro assoni al tectum ottica dove formano connessioni sinaptiche con neuroni postsinaptici tectal. Il circuito di retinotectal girino Xenopus è un popolare modello di sviluppo per studiare la funzione e la formazione di circuiti neurali. Ci sono molti attributi del circuito retinotectal di questo girino che lo rendono un potente modello sperimentale1,2,3. Un attributo importante e il focus di questo articolo, è la capacità di effettuare tutta la cella patch morsetto registrazioni da neuroni tectal, in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello. Con un impianto di perforazione di elettrofisiologia equipaggiato con un amplificatore che supporta la modalità di registrazione a morsetto di tensione e corrente, le registrazioni a cellula intera patch clamp permettono di elettrofisiologia di un neurone a caratterizzarsi ad alta risoluzione. Di conseguenza, tutta la cella patch clamp le registrazioni da neuroni tectal attraverso le fasi chiave della formazione del circuito di retinotectal hanno fornito una comprensione completa e dettagliata dello sviluppo e plasticità di intrinseca4,5 , 6 , 7 e proprietà sinaptiche8,9,10,11 . Combinando le registrazioni a cellula intera patch clamp tectal del neurone, la capacità di esprimere geni o morpholinos di interesse in questi neuroni12e un metodo per valutare il comportamento visivo guidato tramite un stabilito elusione visual test13 promuove la identificazione dei collegamenti tra molecole, circuito funzione e comportamento.
È importante notare che il tipo di alta risoluzione di dati acquisiti da registrazioni di cellula intera patch clamp non sono possibili utilizzando i più recenti approcci di imaging come l’indicatore di calcio genetica GCaMP6, perché anche se utilizzando indicatori di calcio permette l’imaging di calcio dinamiche attraverso le grandi popolazioni di neuroni simultaneamente, non c’è nessun diretto o modo ovvio che i parametri elettrici specifici possono essere ottenuti misurando la fluorescenza di delta nel somata e non c’è alcun modo per tensione morsetto il neurone per misurare rapporti corrente-tensione. Chiaramente questi due approcci distinti, registrazioni elettrofisiologiche e imaging del calcio, possiedono punti di forza non sovrapposte e generare diversi tipi di dati. Pertanto, l’approccio migliore dipende la questione sperimentale specifica affrontata.
Qui, descriviamo il nostro metodo per l’acquisizione di registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni del tectum ottica girino utilizzando una preparazione in vivo , preparazione di tutto il cervello, e una più recente modificato preparazione di tutto il cervello che è stato sviluppato nel nostro laboratorio14 . Nella sezione risultati rappresentante, dimostriamo i vantaggi sperimentali di ogni preparazione e le tipologie di dati che possono essere ottenuti. I limiti e i punti di forza di preparazioni differenti, così come suggerimenti per la risoluzione dei problemi, sono inclusi nella sezione discussione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tutti i metodi descritti in questo lavoro sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15). Dalla fase 42, i girini sono sufficientemente grandi e sufficientemente sviluppati affinché i perni degli insetti possono essere posizionati su entrambi i lati del cervello per le registrazioni in vivo e di eseguire la dissezione del cervello intero. Nelle fasi precedenti, quando i girini sono …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato dalla concessione NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
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