Forberedelser og protokoller for hele cellen Patch klemme opptak i Xenopus laevis Tectal nerveceller
Summary
I dette papiret diskutere vi tre hjernen preparater brukes for registrering av hele cellen oppdateringen klemme for å studere retinotectal kretsen av Xenopus laevis rumpetroll. Hver forberedelse, med sin egen spesielle fordeler, bidrar til den eksperimentelle tractability av Xenopus rumpetroll som modell å studere nevrale krets-funksjonen.
Abstract
Xenopus rumpetroll retinotectal krets, består av netthinnen ganglieceller (RGCs) i øyet som skjemaet synapser direkte på nerveceller i den fiberoptisk tectum, er en populær modell å studere hvordan nevrale kretser selv montere. Muligheten til å utføre hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal nevroner og registrere RGC-utløste svar, enten i vivo eller bruke en hele hjernen forberedelse, har generert en stor mengde høyoppløselige data om mekanismene bak normal , og unormale krets dannelse og funksjon. Beskriver her vi hvordan du utfører i vivo utarbeidelse, opprinnelige hele hjernen utarbeidelse, og mer nylig utviklet vannrett hjernen stykke forberedelse for å få hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal neurons. Hvert preparat har unike eksperimentelle fordeler. I vivo utarbeidelsen gjør opptak av direkte svaret tectal neurons visuelle stimuli projisert på øyet. Hele hjernen forberedelse gir RGC axons aktiveres på en svært kontrollert måte, og vannrett hjernen stykke utarbeidelsen gjør opptak fra over alle lag av tectum.
Introduction
Retinotectal krets er det større komponenten av amfibier visuelle systemet. Det består av RGCs i øyet, som prosjektet deres axons å fiberoptisk tectum hvor de danner synaptic forbindelser med postsynaptic tectal neurons. Xenopus rumpetroll retinotectal krets er en populære utviklingsmessige modellen nevrale krets dannelse og funksjon. Det er mange attributter for denne rumpetroll retinotectal som gjør det en kraftig eksperimentell modell1,2,3. En viktig egenskap, og fokus i denne artikkelen, er muligheten til å utføre hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal nerveceller, i vivo eller bruker en hele hjernen forberedelse. Med en elektrofysiologi riggen utstyrt med en forsterker som støtter spenning – og gjeldende-klemme opptaksmodi, tillate hele cellen oppdateringen klemme innspillinger en Nevron elektrofysiologi å være preget med høy oppløsning. Som et resultat, har hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal neurons over viktige stadier av retinotectal krets dannelsen gitt en detaljert og omfattende forståelse av utviklingen og plastisitet av iboende4,5 , 6 , 7 og synaptic8,9,10,11 egenskaper. Kombinere hele cellen oppdateringen klemme tectal Nevron innspillinger, muligheten til å uttrykke genene eller morpholinos av disse neurons12og metode for å vurdere visuelle guidede atferd via en etablert visuelle unngåelse test13 fremmer den Identifikasjon av koblinger mellom molekyler, krets-funksjonen og virkemåte.
Det er viktig å merke seg at typen høyoppløselig data fra hele cellen oppdateringen klemme innspillinger ikke er mulig med nyere tenkelig tilnærminger som indikatoren genetisk kalsium GCaMP6, fordi selv om bruker kalsium indikatorer tillater avbilding kalsium dynamics over store bestander av neurons samtidig, det er ikke direkte eller åpenbar måte at de spesifikke elektriske parameterne kan fås ved å måle delta fluorescens i somata, og det er ingen måte å spenning klemme Nevron måle nåværende-spenning relasjoner. Åpenbart disse to forskjellige tilnærminger, elektrofysiologiske opptak og kalsium bildebehandling, har ikke-overlappende styrker og generere forskjellige typer data. Derfor den beste tilnærmingen er avhengig av spesifikke eksperimentelle spørsmål blir adressert.
Her beskriver vi vår metode for å skaffe hele cellen oppdateringen klemme opptak fra nevroner i rumpetroll fiberoptisk tectum bruker en i vivo forberedelse, hele hjernen forberedelser, og en nyere endret hele hjernen forberedelse som ble utviklet i vår lab14 . I delen representant resultater viser vi eksperimentelle fordelene av hvert preparat og forskjellige datatypene som kan oppnås. Grenser og styrkene til forskjellige preparater, samt tips for feilsøking, inkluderes under diskusjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle metodene som er beskrevet i dette arbeidet er optimalisert for opptak tectal neurons fra rumpetroll mellom utviklingen scene 42 og 49 (iscenesatt etter Neiuwkoop og Faber15). Scenen 42, i rumpetroll er tilstrekkelig store og tilstrekkelig utviklet slik at insekt pinnene kan plasseres på hver side av hjernen i vivo opptak og for å gjennomføre hele hjernen dissection. På tidligere stadier, når i rumpetroll er i hovedsak todimensjonale (dvs., flat), tilnærminger beskrevet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet av NIH stipendet SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
