Summary

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Published: March 15, 2018
doi:

Summary

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Abstract

Hangi formu synapses doğrudan üzerine nöronlarda optik tectum göz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) oluşan Xenopus iribaş retinotectal devre nasıl sinir devreleri çalışma popüler modelidir kendini topla. Bütün taşıma yeteneği yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar ve RGC uyarılmış yanıt, ya da içinde vivo hücre veya tüm beyin hazırlık kullanarak büyük bir vücut, normal yatan mekanizmaları yüksek çözünürlüklü verilerin üretti ve anormal, devre oluşumu ve işlev. Burada nasıl vivo içinde hazırlık, özgün tüm beyin hazırlık gerçekleştirileceğini açıklar ve daha yakın zamanda yatay beyin dilim hazırlık tectal neurons tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek için geliştirilmiştir. Her hazırlık benzersiz deneysel avantajları vardır. Vivo hazırlık tectal nöronlar doğrudan yanıt göz yansıtılan görsel uyaranlara karşı kayıt sağlayan. Tüm beyin hazırlık için son derece kontrollü bir şekilde var olmak harekete geçirmek RGC akson, ve yatay beyin dilim hazırlık kaydından tectum tüm katmanları arasında sağlar.

Introduction

Retinotectal devre amfibi görsel sisteminin önemli bileşenidir. Hangi onların aksonlar optik tectum nerede postsinaptik tectal nöronlar ile sinaptik bağlantıları oluşturmak için proje RGCs gözünde, oluşur. Xenopus iribaş retinotectal devre nöral devre oluşumu ve işlev eğitim için popüler bir gelişim modelidir. Bu kurbağa’nın retinotectal devrenin bir güçlü deneysel model1,2,3render birçok özniteliği vardır. Bir büyük öznitelik ve odağı bu makalenin tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar, içinde VIVO veya tüm beyin hazırlık kullanarak yürütmek için yeteneği var. Gerilim ve akım kayıt modları kelepçe destekler bir amplifikatör ile donatılmış bir Elektrofizyoloji sondaj platformu ile tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir nöron’ın Elektrofizyoloji yüksek çözünürlükte karakterize edilebilir izin verir. Sonuç olarak, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar retinotectal devre oluşumu temel aşamaları boyunca geliştirme detaylı ve kapsamlı bir anlayış ve plastisite içsel4,5 hazırladık , 6 , 7 ve sinaptik8,9,10,11 özellikleri. Tüm cep telefonu yama kelepçe tectal nöron kayıtları birleştirerek, genlerin veya morpholinos bu nöronların12ve kurulan görsel kaçınma testi13 ile görsel destekli davranışını değerlendirmek için bir yöntem ilgi ifade yeteneği teşvik molekülleri, devre fonksiyon ve davranışı arasındaki bağlantıları tanımlaması.

Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde veri çünkü genetik kalsiyum göstergesi GCaMP6, gibi daha yeni görüntüleme yaklaşımları kullanarak mümkün değildir yüksek çözümleme türü bulunmakla birlikte kalsiyum göstergeler kullanarak görüntüleme verir unutmamak gerekir Kalsiyum dynamics büyük popülasyonlarda nöronların arasında aynı anda, orada hayır doğrudan veya özel elektrik parametreleri somata delta Floresans ölçerek elde edilebilir ve gerilim bir yolu yoktur belirgin şekilde kelepçe ölçmek için nöron akım-gerilim ilişkileri. Açıkça bu ayrı iki yaklaşım, Elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme, üst üste güçlü sahip ve farklı veri oluşturmak. Bu nedenle, en iyi yaklaşım belirli deneysel soru ele alınmaktadır bağlıdır.

Burada, biz tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir vivo içinde hazırlık, tüm beyin hazırlık, kullanarak iribaş optik tectum nöronlar edinme için bizim yöntem tanımlamak ve daha yeni bir14 bizim laboratuarımızda geliştirildi tüm beyin hazırlık modifiye . Temsilcisi sonuçları bölümünde her hazırlık ve elde edilebilir veri farklı türde deneysel avantajları göstermektedir. Sınırları ve güçlü ipuçları sorun giderme, yanı sıra farklı ürünleri bir tartışma bölümünde dahil edilir.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Wyoming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Elektrofizyolojik kayıtlar da dahil olmak üzere tüm yordamları oda sıcaklığında yaklaşık 23 ° c yapılmaktadır Tüm yöntem tanımlamak burada tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. 1. Vivo içinde hazır…

Representative Results

Tüm alan flaş ışık ışık uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için elde edilen yanıt bireysel tectal neurons (şekil 4A) kaydedilir iken retina tahmin edilmektedir. Bu belirli iletişim kuralı her iki nöron (yanıt “On”) açma ve 15 off dönüm ışığa tepki ölçmek için tasarlanmıştır daha sonra “Off yanıt.” ölçmek için s Tectal nöronlar genellikle sağlam ve yanıt kapalı sergi (nöron gösterilen burada içinde k…

Discussion

Bu çalışmada açıklanan tüm yöntemleri tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. Sahne 42 ile Kurbağa yavrularını yeterince büyük ve yeterince gelişmiş böylece böcek pimleri beyin vivo kayıtları için ve tüm beyin diseksiyon taşımak için her iki tarafında yerleştirilebilir. Daha önceki aşamalarında, Kurbağa yavrularını aslında iki boyutlu olduğunda (…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SBC COBRE 1P20GM121310-01 NIH grant tarafından desteklenen.

Materials

Stemi Stereo 508 Zeiss 495009-0006-000  Dissecting microscope
MS-222 "Tricane" Finquel ARF5G Amphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3 Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific P217-500 Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375-1KG Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) Sigma-Aldrich 237124-500G Used to prepare Stienberg's solution  
Magnesium Sulfate (MgSO4) Mallinckrodt Chemicals 6066-04 Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5080-500G Used to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2) J.T. Baker 2444-01 Used to prepare external recording solution
D-glucose Anhydrous Mallinckrodt Chemicals 6066-04 Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate Sigma T2379 Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect Pins Fine Science Tools 26002-10 0.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761028 Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm Fisher Scientific AS4052 Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) BD 305122 Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe  BD 309659 Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glass Sutter Instrument BF150-86-10HP Pulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipes Kimberly-Clark 34120 Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B Current clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller Sutter Instrument MP-285/T Control for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green) Thorlabs M530F2 Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) FHC 30207 Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex Stimulator A.M.P.I. (Israel)  Contact manufacturer Flexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier Molecular Devices 2500-0157 Amplifier for voltage- and current-clamp recording 
Digidata 1322A digitizer Molecular Devices 2500-135 Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1 Zeiss 491404-0001-000  Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab Table TMC 63-533 Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit Dell D06D001 Computer running electrophysiology software
c2400 CCD camera Hamamatsu 70826-5 Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades Gillette CMM01049 Platinum-coated stainless razor blades
Transfer Pipets Fisher Scientific 13-711-7M Disposable Polyethylene transfer pipets

References

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Play Video

Cite This Article
Liu, Z., Donnelly, K. B., Pratt, K. G. Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57465, doi:10.3791/57465 (2018).

View Video