이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.
중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 세포 기반 치료에 대 한 주요 셀 소스. 관절 강 활 액 액체에서 MSCs 연골 조직 공학에 잠재적으로 사용할 수 있었습니다. 활 액 액체 (SF-MSCs)에서 MSCs 간주 되었습니다 관절 재생을 위한 유망한 후보자 그리고 그들의 잠재적인 치료 혜택 했다 그들 중요 한 연구 주제를 늦게. 뉴질랜드 백색 토끼의 무릎 구멍에서 SF-MSCs 인간의 재생 의학을 평가 하는 최적화 된 변환 모델로 사용할 수 있습니다. CD90 기반 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 기술을 통해이 프로토콜 성공적으로 토끼 SF-MSCs (rbSF-MSCs)이 토끼 모델에서 가져오고 더 완벽 하 게 유도 하는 그들을 차별화 하 여 이러한 셀의 MSC 표현 형 보여줍니다. osteoblasts, adipocytes, 그리고 chondrocytes입니다. 따라서,이 방법은 세포 생물학 연구와 간단한 장비 및 절차를 사용 하 여 조직 공학에 적용할 수 있습니다.
MSCs 연골 병 변을 위해 특히 재생 의학에 대 한 귀중 한 소스 제안 되어 있다. MSCs, chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, 골격 myocytes 및 내장 stromal 세포를 포함 하 여 광범위 하 게 그들의 높은 확장 속도 멀티 혈통 차별화 잠재적인1인해 줄기 세포 이식에 대 한 영역을 확장 합니다. MSCs는 골격 근육, 막, 골 수 및 지방 조직2,,34에서 격리 될 수 있습니다. 결과 또한 confirmed 활 액 액체에서 MSCs의 존재 그리고 이전 연구는 관절 재생5,6유망한 후보자로 활 액 액체 파생 MSCs (SF-MSCs)를 발견 했다.
그러나, 연구와 임상 실험 인간의 샘플에 많은 윤리적 문제에 적용 됩니다. 대신, 토끼 고 가장 일반적으로 사용 되는 동물 종 MSCs의 이식 연골 손상을 복구할 수 있습니다 설명 하기 위해 계속. 최근 몇 년 동안, 연구원의 증가 수는 토끼 중간 엽 줄기 세포 (rbMSCs) 모두 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서이 세포는 그들의 세포질 생물학 및 조직 생리학에서 인간의 비슷합니다 MSCs. 마찬가지로, rbMSCs는 인간의 MSCs에서 스핀 들 섬유 형태를 표시 하는 플라스틱 표면에 고착 할 수 있다. 또한, 토끼 중간 엽 샘플 간단 하 고 쉽게7을 얻을 수 있다. 또한, 가장 중요 한 포인트는 rbMSCs CD44, CD90, CD105, 등 표면 마커를 표현 하 고 기준으로 MSC 인구의 식별에 대 한 동의 잠재적인 다중 계보 차별화 유지 되는 세포 치료8,9에 대 한 국제 사회에 의해 정의. 특히, synovial 유체 chondroprogenitors 때 TGF-β1, 따라서 그들 phenotypically 관절 연골 재생10,11, 적당 한 셀 소스 만들기에 의해 유도 된 비 hypertrophic chondrogenesis 할 수 있다 12.
그러나, SF MSCs의 절연 탯, 지방 조직, 말 초 혈액 및 골 수를 포함 하 여 다른 조직에서 크게 다르다. 현재, 비록 흐름 cytometry 방법을 사용 하려면 특정 환경 및 매우 비싼 악기13cytometry 및 immunomagnetic 구슬 기반 정렬 정화 및 SF-MSCs의 정렬에 대 한 가장 일반적인 방식입니다.
이 문서는 흰 토끼 뉴질랜드에서 활 액 액체 샘플의 간단 하 고 최소한 침략 적 컬렉션에 대 한 절차를 제공합니다. 절차 동안, rbSF-MSCs 안정적으로 확장 된 생체 외에서 그리고 CD90 긍정적인 자기 비드 기반 절차와 격리. 마지막으로, 프로토콜에는 높은 순도와 수확된 셀 소스에서 생존 MSCs를 구하는 방법을 보여 줍니다.
이 프로토콜에서 격리 rbSF-MSCs는 그들의 형태학, 특정 마커 및 pluripotency 줄기 세포에 대 한 표현에 따라 특징 이다. CD45와 CD34의 표현 부정적인 반면 교류 cytometry 기반 immunophenotyping CD44 및 CD105의 중요 한 긍정적인 표현을 보여준다. 마지막으로, 분석 결과 생체 외에서 rbSF-MSCs에 대 한이 셀의 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화를 보여 줍니다.
활 액 액체에 MSCs의 존재 휴대에 기초를 둔 치료에 대 한 대안을 제공합니다. 이전 연구 부상 사이트 후 부상 기간5와 긍정적으로 상관 될 수 있습니다 그들의 활 액 액체에 중간 엽 줄기 세포의 높은 금액을 포함 나타났습니다. 활 액 액체에 MSCs 부상18,19후 자연 치유 향상을 위한 조직에 도움이 될 수 있습니다. 문학에서 SF MSCs의 임상 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 다음 교부 금에 의해 재정적으로 지원 되었다: 중국의 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81772394); 심천 대학 (No. 2016031638); 높은 수준의 의료 분야 건설을 위한 기금 광 동성, 중국 (번호의 의료 연구 재단 A2016314); 심천 과학 및 기술 프로젝트 (제 JCYJ20170306092215436; 롤 JCYJ20170412150609690; 롤 JCYJ20170413161800287; 롤 SGLH20161209105517753; 롤 JCYJ20160301111338144)입니다.
Reagents | |||
MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
Equipment | |||
MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |