마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

요약

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 세포 기반 치료에 대 한 주요 셀 소스. 관절 강 활 액 액체에서 MSCs 연골 조직 공학에 잠재적으로 사용할 수 있었습니다. 활 액 액체 (SF-MSCs)에서 MSCs 간주 되었습니다 관절 재생을 위한 유망한 후보자 그리고 그들의 잠재적인 치료 혜택 했다 그들 중요 한 연구 주제를 늦게. 뉴질랜드 백색 토끼의 무릎 구멍에서 SF-MSCs 인간의 재생 의학을 평가 하는 최적화 된 변환 모델로 사용할 수 있습니다. CD90 기반 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 기술을 통해이 프로토콜 성공적으로 토끼 SF-MSCs (rbSF-MSCs)이 토끼 모델에서 가져오고 더 완벽 하 게 유도 하는 그들을 차별화 하 여 이러한 셀의 MSC 표현 형 보여줍니다. osteoblasts, adipocytes, 그리고 chondrocytes입니다. 따라서,이 방법은 세포 생물학 연구와 간단한 장비 및 절차를 사용 하 여 조직 공학에 적용할 수 있습니다.

서론

MSCs 연골 병 변을 위해 특히 재생 의학에 대 한 귀중 한 소스 제안 되어 있다. MSCs, chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, 골격 myocytes 및 내장 stromal 세포를 포함 하 여 광범위 하 게 그들의 높은 확장 속도 멀티 혈통 차별화 잠재적인¹인해 줄기 세포 이식에 대 한 영역을 확장 합니다. MSCs는 골격 근육, 막, 골 수 및 지방 조직^2,,34에서 격리 될 수 있습니다. 결과 또한 confirmed 활 액 액체에서 MSCs의 존재 그리고 이전 연구는 관절 재생^5,6유망한 후보자로 활 액 액체 파생 MSCs (SF-MSCs)를 발견 했다.

그러나, 연구와 임상 실험 인간의 샘플에 많은 윤리적 문제에 적용 됩니다. 대신, 토끼 고 가장 일반적으로 사용 되는 동물 종 MSCs의 이식 연골 손상을 복구할 수 있습니다 설명 하기 위해 계속. 최근 몇 년 동안, 연구원의 증가 수는 토끼....

프로토콜

모든 동물 실험 지역 윤리 위원회 지침에 따라 실시 했다 그리고 모든 동물성 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 심천 제 2 인민 병원, 심천 대학으로 승인 했다.

1. 격리와 rbSF-MSCs 문화

1. 동물 절차에 대 한 준비
   1. RbSF의 컬렉션에 대 한 skeletally 성숙 여성 뉴질랜드 백색 토끼를 준비-MSCs. 마 취와 arthrocentesis 절차 전에 어느 날 토끼의 임상 시험 수행.
      참고: 검 무게 (2.0-2.5 k g), 성별 (여성), 고 체온, 호흡 속도 심장 박동을 포함 해야 합니다. 임상적으로 건강 한 토끼에 대 한 매개 변수 간격 있으며 호흡 속도 대 한 30-50 분, 심장 박동에 대 한 220-280 분 38-39 ° C 온도 대 한.
   2. 동물 마 취 전에 6 h에 대 한 빠른.
2. 준비 및 동물 마 취에 대 한 절차
   1. 감 금 소를 가진 토끼를 억제 ( 재료의 표참조), 다음 3 %pentobarbital 나트륨 전신 마 취에 대 한 1 mL/kg의 복용량에 한계 귀 정 맥에 주사 하 고.

결과

고립, 정화, 및 rbSF-MSCs의 문화:
이 프로토콜 맥을 사용 하 여 rbSF-MSCs, MSC 표면 마커 CD90의 식에 따라 분리. RbSF-MSCs의 고립, 정화, 그리고 특성화 및 생체 외에서 문화 프로토콜의 공정 흐름도 그림 1에 표시 됩니다.

마그네틱 활성화 셀 CD90와 (맥)을 정렬 후 셀 형태:
첫째, 맥, CD90 자석 구슬 가진 immunolabel MSCs에 대 한 원심, 후 resuspend precooled 정렬 버퍼의 80 µ L에 10⁷ 셀의 최대 고 CD90 자석 구슬, vortexing와 15 분 동안 4 ° C에 외피 다음의 20 µ L를 추가 합니다. 그 후, 셀 .......

토론

활 액 액체에 MSCs의 존재 휴대에 기초를 둔 치료에 대 한 대안을 제공합니다. 이전 연구 부상 사이트 후 부상 기간⁵와 긍정적으로 상관 될 수 있습니다 그들의 활 액 액체에 중간 엽 줄기 세포의 높은 금액을 포함 나타났습니다. 활 액 액체에 MSCs 부상^18,19후 자연 치유 향상을 위한 조직에 도움이 될 수 있습니다. 문학에서 SF MSCs의 임상 적용 거의 적용 되었습니다 주로 하기 때문에 관절에 SF MSCs의 메커니즘 남아 정의 되지 않은²⁰. 존스 외. ²¹ 보고는 무릎 관절에 hSF-MSC 숫자는 크게 7-fold 증가 관절염 (OA)의 초기 단계. 그들은 증가 SF MSCs 관절의 생리 적 항상성 유지에 기여할 수 있는 생각.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	37°C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조
MesenGro 보충제	StemRD	MGro-500 M1512	MSC 배양 매체의 구성 요소
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSC 분화 배지
등장성 식염수	Litai, 중국	5217080305	Cavity 관절 천자 시술 시약
인산염 완충 식염수(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	MSC 배양 배지의 구성 요소
포비돈 요오드 용액	광동, 중국	150605	살균제
75 % 에탄올	Lircon, 중국	170917	살균제
0.25 % 트립신 / EDTA	Gibco Inc.	25200-056	세포 해리 시약
1% 페니실린-스트렙토마이신	Gibco Inc.	15140-122	MSC의 구성 요소
중간 MACS 러닝 버퍼	MiltenyiBiotec	5160112089	인산염 완충 식염수(PBS), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2 mMEDTA
CD90 항체 결합 MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	자기 활성화 세포 분류용
피루브산 나트륨	Sigma-Aldrich	P2256	MSC의 구성 요소 연골 생성 분화
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	MSC의 성분 골 형성 분화
ITS	BD	354352	1%, MSC의 성분 연골 생성 분화
L-프롤린	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, MSC의 성분
L-아스코르브산-2-인산염	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, MSCs 연골 생성 분화
성분 3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, 지방 생성 분화 성분
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, 지방 생성 분화 성분
TGFβ 1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, MSCs 연골형성 분화
및 알파;-글리세롭스페이트	Sigma-Aldrich	G6751	MSCs 골형성 분화
성분 CD34 다클론 항체, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	조혈 줄기세포 마커
마우스 antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 멤브레인 당단백질(MSC 마커)
CD45(단클론 항체)	Bio-Rad	MCA808GA	조혈 줄기세포 마커
CD105 항체	Genetex	GTX11415	MSC 마커
이소프로필 알코올	Sigma-Aldrich	I9030	침전 RNA 추출 유기상
Trichloromethane	Wenge, China	61553	추출물 총 RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	분리 총 RNA
SYBR 녹색 마스터 믹스	Takara Bio, 일본	RR420A	PCR 테스트
cDNA 합성 키트	Takara Bio, 일본	RR047A	상보적 DNA로 역 전사
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	칼슘 화합물 염색
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	연골 조직의 염색
오일 레드 O 용액	Sigma-Aldrich	O1391L	지질 액포 염색
Equipment
MiniMACS 분리기	MiltenyiBiotec	130-042-102	자기 활성화 세포 분류용
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	자기 활성화 세포 분류용
MS 컬럼	MiltenyiBiotec	130-042-201	자기 활성화 세포 분류용
셀 스트레이너	FALCON Inc.	352340	40 &뮤; M 나일론
혈구계	ISOLAB Inc.	075.03.001	세포 계수
Falcon 100 mm 접시	Corning	353003	세포 배양 접시
미세 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-150-C	RNA 추출 및 PCR
원심분리기 튜브	Sigma-Aldrich	91050	감마 멸균
고속 원심분리기	Eppendorf	5804R	원심분리기
이산화탄소 셀 인큐베이터	Thermo scientific	3111	세포 배양
Real-Time PCR 기기	Life Tech	QuantStudio	Real-Time 정량 중합효소 연쇄 반응
유세포 분석기	BD Biosciences	342975	세포 분석기
피펫터	Eppendorf	O25456F	액체
클로닝 실린더	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	개별 세포 식민지 분리 및 선택
멸균 피하 주사기	Double-Dove, 중국	131010	관절 천자 절차
토끼 케이지	Zhike, 중국	ZC-TGD	토끼 억제

무함유 셀