Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at rense exosomes fra både plasma og serum med reduceret Co rensning af ikke-exosomal blodproteiner. Den optimerede protokol omfatter ultrafiltrering, protease behandling og størrelse udstødelse kromatografi. Forbedret rensning af exosomes fordele downstream analyser, herunder mere nøjagtig kvantificering af vesikler og proteom karakterisering.
Abstract
Exosomes, en type af nanovesicle frigives fra alle celletyper, kan isoleres fra alle kropslige væske. Indholdet af exosomes, herunder proteiner og RNA’er, er unikke for celler, som de afledes og kan bruges som indikatorer for sygdom. Flere fælles berigelse protokoller, herunder ultracentrifugering, give exosomes belæsset med opløseligt protein forureninger. Specifikt, har vi fundet at de mest rigelige proteiner i blodet ofte Co rense med exosomes og kan forvirre downstream proteom undersøgelser, vægrer identifikation af lav overflod biomarkør kandidater. Yderligere bekymring er irreproducibility af exosome protein kvantificering på grund af usammenhængende repræsentation af ikke-exosomal protein niveauer. Protokollen detaljeret her blev udviklet for at fjerne ikke-exosomal proteiner, der co renser sammen med exosomes, tilføje rigor exosome rensningsproces. Fem metoder blev sammenlignet ved hjælp af parrede blod plasma og serum fra fem donorer. Analyse ved hjælp af nanopartikel tracking analyse og mikro bicinchoninic syre protein analyse afslørede, at en kombineret protokol udnytte ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi givet optimal vesikel berigelse og opløseligt protein fjernelse. Western blotting blev brugt til at kontrollere, at de forventede rigelige Blodproteiner, herunder albumin og apolipoproteiner, var opbrugt.
Introduction
Exosomes er nanovesicles (spænder i størrelse fra 30 nm til 150 nm) udgivet af næsten alle celler i den menneskelige krop til at lette celle-til-celle kommunikation behandler1,2. Interessant, sammensætningen af exosomes ændres afhængigt af celler af oprindelse samt sundhedstilstanden hos de enkelte3,4,5. Derudover exosomes kan hentes fra flere biologiske væsker såsom: spyt, urin og blod2. På grund af disse funktioner er exosomes anses for at være en god kilde til sygdommen biomarkører. Desværre er der ingen standard metode til isolering af exosomes. Nogle laboratorier overveje omstændelig centrifugering, med en sidste højhastigheds trin på 100.000 x g ved hjælp af tæthed gradienter som den gyldne standard metode til exosome isolation. Nylige undersøgelser har dog vist, at ultracentrifugering inducerer sammenlægning af exosomes med opløselige proteiner og andre exosomes, udover påvirker exosome integritet, som begge kan hæmme downstream programmer6,7 . Andre almindelige metoder til exosome isolation omfatter, men er ikke begrænset til: udfældning af kommercielle polyethylenglycol (PEG) baseret reagenser, centrifugal ultrafiltrering og størrelse-udelukkelse kromatografi (sek). De kommercielle reagenser med polyethylenglycol (PEG) polymerer berige exosomes af forårsager dem til at udfælde og danne en pellet. Begrænsninger ved hjælp af denne polymer er forurening med resterende PIND polymer og en overflod af opløselige exosomal proteiner i det endelige produkt. Ultrafiltrering udnytter centrifugering for at rense og koncentrere blærer ved hjælp af en cellulose membran; exosomes bevares over filtret, mens mindre urenheder og andre proteiner passerer gennem membranen7,8. Ligesom andre metoder har centrifugal ultrafiltrering en begrænset kapacitet til at rense exosomes på grund af opretholdelsen af høje niveauer af ikke-exosomal proteiner, herunder proteinkomplekser og aggregater. Endelig bruger sek rensning porøse harpiks til at adskille molekyler af størrelse. SEC har vist lovende resultater, at overvinde de fleste af de problemer med andre metoder ved at indfange fleste af forurenende proteiner og bevare exosomal integritet, da isolation er baseret på tyngdekraften eller lavtryks systemer7, 9. Større protein aggregater og lipoproteiner10 co isolation under sek påvirker imidlertid renheden af endelige exosome forberedelse. Mens nogle metoder er blevet testet for exosome rensning fra celle kultur analysere og plasma7eller kun plasma9,11, er der ingen oplysninger om udførelsen af metoder direkte sammenligne blod plasma og serum fra samme individ.
Her, fokuserer vi på rensning af blod exosomes ved at sammenligne en bred vifte af arbejdsprocesser, der skal afgøre, om vesikel berigelse teknikker er oversætbare mellem plasma og serum. Nanopartikel tracking analyse og vestlige skamplet blev brugt til at kvantificere forskellene i exosome koncentration, renhed og protein sammensætning i slut produkter. Den endelige metode, beskrevet i denne protokol, øger vesikel numre og reducerer ikke-exosomal protein niveauer. Vigtigere er, er en drastisk reduktion af fælles co fældningen proteiner herunder albumin og apolipoproteiner påvist. Høj overflod af disse to proteiner i blodet og den hyppighed, hvormed de Co rense med exosomes årsager uoverensstemmelser mellem “renset” prøver, skævvridning af downstream analyser. Denne protokol omfatter brug af et kommercielt tilgængelige sek harpiks; harpiksen er sammensat af porøse perler som proteiner mindre end 700 kDa kan indtaste perlerne. Én gang inde, proteiner, bevares ved en octylamine ligand. Eluatet er sammensat af exosomes og molekyler større end 700 kDa12. Derudover for at reducere protein aggregater og apolipoproteiner, som unddrager sig perle diffusering, medtager vi en protease fordøjelsen trin i arbejdsprocessen. I øjeblikket, er der ikke nogen enkelt teknik i stand til at maksimere exosome udbytte samtidig reducere Co rensende ikke-exosomal proteiner. Denne undersøgelse viser, at en rensning protokol, der kombinerer en protease fordøjelsen forbehandling med flere genopretning og rensning metoder kan bruges til at øge exosome udbytte og renhed fra blod serum og plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
En optimeret metode til at øge renhed og udbyttet af exosomes fra blodet vil øge evnen til at præcist mine ekstracellulære vesikler som en kilde til biomarkører for flere sygdomme. Standard metoder, der i øjeblikket anvendes til at isolere exosomes, specifikt, ultracentrifugering og nedbør metoder, har flere ulemper, herunder exosome sammenlægning og pelleringsmidler af opløselige proteiner7,17, 18. Alternativt, brug a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af interne midler fra CSU (til KMD), ATCC kontrakt #2016-0550-0002 (en underleverance af NIAID HHSN272201600013C), og The Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (til KMD/NKG). Vi takker NSF forskningserfaring for Undergraduates (REU) sommerprogram på Colorado State University for yderligere support.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
