Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum
Summary
Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.
Abstract
Exosomes, een soort nanovesicle verlost van alle celtypes, kunnen worden geïsoleerd van eventuele lichamelijke vloeistof. De inhoud van exosomes, met inbegrip van eiwitten en de RNAs, zijn uniek voor de cellen waaruit ze zijn afgeleid en kunnen worden gebruikt als indicatoren van ziekte. Verschillende gemeenschappelijke verrijking protocollen, waaronder ultracentrifugatie, opbrengst exosomes beladen met oplosbaar eiwit contaminanten. Specifiek, hebben we geconstateerd dat de meest voorkomende eiwitten in het bloed vaak mede met exosomes zuiveren en kunnen verwarren downstream proteomic studies, frustreert de identificatie van lage overvloed biomerker kandidaten. Is irreproducibility van exosome eiwit kwantificering vanwege inconsistent vertegenwoordiging van niet-exosomal eiwitniveaus extra zorgwekkend. Het protocol hier gedetailleerde werd ontwikkeld voor het verwijderen van niet-exosomal-eiwitten die mede samen met exosomes zuiveren, strengheid toe te voegen aan het zuiveringsproces van exosome. Vijf methodes werden vergeleken met behulp van de gepaarde bloed plasma en serum van vijf donoren. Analyse met behulp van nanoparticle volgen analyse en micro-bicinchoninic zuur eiwit kwantitatieve analyse bleek dat een gecombineerde protocol met behulp van ultrafiltratie en grootte uitsluiting chromatografie het blaasje optimale verrijkings- en oplosbaar eiwit verwijdering leverde. Westelijke bevlekken werd gebruikt om te verifiëren dat de verwachte overvloedige bloedeiwitten, met inbegrip van albumine en apolipoproteins, waren uitgeput.
Introduction
Exosomes zijn nanovesicles (variërend in grootte van 30 nm tot 150 nm) uitgebracht door bijna alle cellen in het menselijk lichaam te vergemakkelijken van cel naar cel communicatie verwerkt1,2. Interessant is dat de samenstelling van de exosomes verandert afhankelijk van de cellen van oorsprong, alsmede de gezondheidsstatus van de individuele3,4,5. Bovendien exosomes kunnen worden opgehaald uit verschillende biologische vloeistoffen zoals: speeksel, urine en bloed2. Vanwege deze kenmerken, exosomes worden beschouwd als een goede bron van ziekte biomarkers. Helaas, er is geen standaard methode voor de isolatie van de exosomes. Sommige laboratoria vinden meerstaps centrifugeren, met een laatste snelle stap bij 100.000 x g met behulp van dichtheid verlopen als de gouden standaard methode om exosome te isoleren. Recente studies hebben echter aangetoond dat ultracentrifugatie induceert aggregatie van exosomes met oplosbare eiwitten en andere exosomes, naast het beïnvloeden van de integriteit van de exosome, die beide kunnen nadelig zijn voor stroomafwaarts toepassingen6,7 . Andere gemeenschappelijke methoden voor exosome isolatie omvatten, maar zijn niet beperkt tot: neerslag door commerciële polyethyleenglycol (PEG) gebaseerd reagentia, centrifugaal ultrafiltratie en grootte-uitsluiting chromatography (SEC). De commerciële reagentia met polyethyleenglycol (PEG) polymeren verrijken exosomes door waardoor ze neerslaan en vormen een pellet. Beperkingen met behulp van dit polymeer zijn besmetting met residuele PEG polymeer en een overvloed van oplosbare niet-exosomal eiwitten in het eindproduct. Ultrafiltratie maakt gebruik van centrifugeren om te zuiveren en het concentreren van de blaasjes met een cellulose membraan; exosomes blijven behouden boven het filter, terwijl kleinere onzuiverheden en andere eiwitten de membraan7,8 doorheen. Net als andere methoden heeft centrifugaal ultrafiltratie een beperkte capaciteit voor het zuiveren van exosomes als gevolg van de handhaving van hoge niveaus van niet-exosomal eiwitten, met inbegrip van eiwitcomplexen en aggregaten. Ten slotte gebruikt de SEC zuivering poreuze hars te scheiden van moleculen door grootte. SEC heeft aangetoond veelbelovende resultaten, het overwinnen van de meeste van de problemen die met andere methoden door het vastleggen van de meerderheid van hun gehalte aan verontreinigingen eiwitten en het behoud van de integriteit van de exosomal, aangezien isolatie is gebaseerd op de zwaarte of de lagedruk systemen7, 9. De co Isolatievan groter eiwit, aggregaten en lipoproteïnen10 tijdens SEC heeft echter gevolgen voor de zuiverheid van de voorbereiding van de definitieve exosome. Terwijl sommige methoden zijn getest voor exosome zuivering van cel cultuur supernatant en plasma7, of alleen plasma9,11, is er geen informatie over de prestaties van methoden rechtstreeks vergelijken van bloed plasma en serum van dezelfde persoon.
Hier, richten we ons op de zuivering van bloed exosomes door het vergelijken van een verscheidenheid van werkstromen om te bepalen of blaasje verrijking technieken vertaalbare tussen plasma en serum. Nanoparticle voor het bijhouden van analyse en westelijke vlek werden gebruikt om het kwantificeren van de verschillen in exosome eiwit concentratie en zuiverheid samenstelling in de eindproducten. De laatste methode, beschreven in dit protocol, verhoogt vesikel nummers en vermindert van niet-exosomal eiwitniveaus. Nog belangrijker is, wordt een drastische vermindering van de gemeenschappelijke co neerslagmiddel eiwitten, met inbegrip van albumine en apolipoproteins aangetoond. De hoge overvloed van deze twee eiwitten in het bloed en de frequentie waarop zij mede met exosomes oorzaken inconsistenties tussen de “zuivere” monsters zuiveren, scheeftrekken van de stroomafwaartse analyses. Dit protocol omvat het gebruik van een commercieel beschikbare SEC hars; de hars is samengesteld uit poreuze parels waarin eiwitten kleiner dan 700 kDa de parels kunnen invoeren. Eenmaal binnen, de eiwitten worden behouden door een octylamine ligand. Het eluaat bestaat uit exosomes en moleculen groter dan 700 kDa12. Bovendien ter beperking van de eiwit-aggregaten en apolipoproteins die kraal overlapping onttrekken, nemen we een protease spijsvertering stap in de werkstroom. Op dit moment is er niet één techniek staat het maximaliseren van de opbrengst van de exosome terwijl het verminderen van mede zuiverende niet-exosomal-eiwitten. Deze studie toont aan dat een zuivering protocol dat een protease spijsvertering voorbehandeling met meerdere methoden voor herstel en zuivering combineert kan worden gebruikt om exosome rendement en zuiverheid van het bloed, serum en plasma te verhogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een geoptimaliseerde methode om te verhogen, de zuiverheid en het rendement van exosomes uit bloed zal het verhogen van het vermogen om nauwkeurig de mijne van extracellulaire blaasjes als een bron van biomarkers voor verschillende ziekten. De standaardmethoden momenteel gebruikt voor het isoleren van exosomes, in het bijzonder ultracentrifugatie en neerslag methoden, hebben verscheidene nadelen met inbegrip van bundeling van exosome en pillering van oplosbare eiwitten7,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de interne middelen van CSU (aan KMD), ATCC contract #2016-0550-0002 (een toeleveringscontract van NIAID HHSN272201600013C), en de Bill en Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (tot KMD/NKG). Wij danken de NSF onderzoekervaring voor studenten (REU) zomerprogramma bij Colorado State University voor aanvullende ondersteuning.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
