Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.
Abstract
Exosomen, eine Art von Nanovesicle befreit alle Zelltypen können von jeder Körperflüssigkeit isoliert werden. Den Inhalt des exosomen, einschließlich Proteinen und RNAs, sind einzigartig für die Zellen, aus denen sie stammen und können als Indikatoren für die Krankheit verwendet werden. Mehrere gemeinsame Bereicherung Protokolle, einschließlich Ultrazentrifugation, Ausbeute exosomen beladen mit lösliche Protein Verunreinigungen. Insbesondere haben wir festgestellt, dass die am häufigsten vorkommende Proteine im Blut oft gemeinsam mit exosomen reinigen und können verwirren nachgelagerten Proteomik-Studien, die Identifizierung von niedrigen Fülle Biomarker Kandidaten zu vereiteln. Weitere Anliegen ist Unreproduzierbarkeit exosom Protein Quantifizierung wegen inkonsistenten Darstellung der nicht-Exosomal-Protein-Ebene. Das Protokoll hier besprochen wurde entwickelt, um nicht Exosomal Proteine zu entfernen, die zusammen mit exosomen, die exosom Reinigungsprozess strenge hinzufügen Co zu reinigen. Fünf Methoden wurden verglichen mit gekoppelten Blut-Plasma und Serum von fünf Spendern. Analyse mit Nanopartikel tracking-Analyse und Mikro Bicinchoninic sauren Protein Assay ergab, dass ein kombiniertes Protokoll Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie nutzen die optimale Vesikel Bereicherung und lösliche Protein Entfernung ergab. Westliche Beflecken wurde verwendet, um sicherzustellen, dass die erwarteten reichlich Blutproteine, einschließlich Albumin und Apolipoproteins, erschöpft waren.
Introduction
Exosomen sind Nanovesicles (in der Größe von 30 nm bis 150 nm) veröffentlicht durch fast alle Zellen im menschlichen Körper zur Erleichterung der Kommunikation von Zelle zu Zelle1,2verarbeitet. Interessanterweise ändert sich die Zusammensetzung des exosome abhängig von den Zellen der Herkunft sowie den Gesundheitszustand des einzelnen3,4,5. Darüber hinaus können exosomen aus mehreren biologischen Flüssigkeiten wie z. B. abgerufen werden: Speichel, Urin und Blut2. Aufgrund dieser Eigenschaften exosomen gelten eine gute Quelle von Krankheit Biomarker. Leider gibt es keine Standardmethode für die Isolierung von exosomen. Einige Labors prüfen, mehrstufige Zentrifugation mit High-Speed-abschließend bei 100.000 x g mit Dichtegradienten als Goldstandard-Methode für die exosom Isolierung. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass die Ultrazentrifugation induziert Aggregation von exosomen mit löslichen Proteinen und anderen exosomen, neben den Auswirkungen auf exosom Integrität, beide mit downstream-Anwendungen6,7 behindern können . Andere gängige Methoden der exosom Isolation beinhalten, aber beschränken sich nicht auf: Niederschlag von kommerziellen Polyethylenglykol (PEG) basiert, Reagenzien, zentrifugale Ultrafiltration und Größe-Exclusion Chromatography (SEC). Die kommerziellen Reagenzien mit Polyethylenglykol (PEG) Polymere bereichern exosomen veranlaßt, Niederschlag und bilden ein Pellet. Einschränkungen mit diesem Polymer sind Kontaminationen mit residual PEG Polymer und eine Fülle von löslichen nicht Exosomal Proteine im Endprodukt. Ultrafiltration nutzt Zentrifugation zu reinigen und Bläschen mit einer Zellulose-Membran zu konzentrieren; exosomen werden oberhalb des Filters beibehalten, während kleinere Verunreinigungen und andere Proteine die Membran-7,–8 passieren. Genau wie andere Methoden hat zentrifugale Ultrafiltration eine begrenzte Kapazität, exosomen aufgrund des Eigentumsvorbehalts mit hohem Maß an nicht Exosomal Proteine, einschließlich Proteinkomplexe und Aggregate zu reinigen. Schließlich verwendet SEC Reinigung porösen Harz zum Trennen von Molekülen durch Größe. SEC gezeigt hat viel versprechende Ergebnisse, die meisten Probleme mit anderen Methoden durch die Erfassung der Mehrheit der Verunreinigung Proteine und Exosomal Integrität zu bewahren, da Isolation auf Schwerkraft oder Tiefdruckgebiete7zu überwinden, 9. Die Co Isolation von größeren Protein Aggregate und Lipoproteine10 während SEC betrifft jedoch die Reinheit der endgültigen exosom Zubereitung. Während einige Methoden für die exosom Reinigung von Zelle Kultur Überstände und Plasma7oder nur Plasma9,11geprüft worden sind, gibt es keine Informationen über die Leistung der Methoden direkt vergleichen Blut Plasma und Serum von der gleichen Person.
Hier konzentrieren wir uns auf die Reinigung von Blut exosomen durch den Vergleich verschiedener Arbeitsabläufe zu bestimmen, ob Vesikel Anreicherung Techniken zwischen Plasma und Serum übersetzbar sind. Nanopartikel, die tracking-Analyse und western-Blot wurden verwendet, um die Unterschiede in exosom Konzentration, Reinheit und Eiweiß-Zusammensetzung in den Endprodukten zu quantifizieren. Die letzte Methode, detailliert in diesem Protokoll erhöht Vesikel Zahlen und nicht-Exosomal-Protein-Niveau reduziert. Wichtig ist, ist eine drastische Reduzierung der gemeinsamen Co auslösenden Proteine wie Albumin und Apolipoproteins gezeigt. Die hohe Fülle dieser beiden Proteine im Blut und die Frequenz, bei der sie mit exosomen Ursachen Inkonsistenzen zwischen “gereinigten” Proben, neigen die nachgeschalteten Analysen Co zu reinigen. Dieses Protokoll beinhaltet die Nutzung eines im Handel erhältlichen SEC-Harzes; das Harz besteht aus porösen Kügelchen, in denen Proteine kleiner als 700 kDa die Perlen eingeben können. Einmal drinnen, die Proteine durch eine Octylamine-Liganden bleibt bestehen. Das Eluat besteht aus exosomen und Moleküle größer als 700 kDa12. Darüber hinaus umfassen wir um reduzieren die Protein-Aggregate und Apolipoproteins die Wulst Überfüllen zu entziehen, einen Protease Verdauung Schritt im Workflow. Derzeit gibt es keine einzige Technik in der Lage, Ertragssteigerung exosom gleichzeitiger Reduzierung Co reinigende nicht Exosomal Proteine. Diese Studie zeigt, dass eine Reinigung-Protokoll, die eine Protease Verdauung Vorbehandlung mit mehreren Rückgewinnung und Reinigung Methoden kombiniert exosom Ausbeute und Reinheit von Blutserum und Blutplasma zu erhöhen verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine optimierte Methode zur Erhöhung der Reinheit und Ausbeute von exosomen aus Blut erhöht die Fähigkeit, genau meins extrazelluläre Vesikel als Quelle von Biomarkern für verschiedene Krankheiten. Die Standardmethoden zur derzeit exosomen, speziell, isolieren Ultrazentrifugation und Niederschlag Methoden, haben mehrere Nachteile einschließlich exosom Aggregation und Pelletierung von löslichen Proteinen7,17, 18. Alternat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch interne Fonds von CSU (, KMD), ATCC Vertrag #2016-0550-0002 (einen Untervertrag NIAID HHSN272201600013C), und der Bill und Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (, KMD/NKG) unterstützt. Wir danken der NSF Forschungserfahrung für Studierende (REU)-Sommer-Programm an der Colorado State University für zusätzliche Unterstützung.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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