Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.
Abstract
Esosomi, un tipo di nanovesicle rilasciato da tutti i tipi di cellule, possono essere isolati da qualsiasi fluido corporeo. Il contenuto di esosomi, tra cui proteine ed RNA, è univoco per le cellule da cui essi sono derivati e può essere utilizzati come indicatori della malattia. Diversi protocolli comuni di arricchimento, tra cui ultracentrifugazione, resa di esosomi caricati di contaminanti di proteina solubile. In particolare, abbiamo trovato che le proteine più abbondanti all’interno del sangue spesso co-purificano con esosomi e possono confondere studi di proteomica a valle, vanificando l’identificazione dei candidati biomarcatore abbondanza bassa. Di ulteriore preoccupazione è irriproducibilità di quantificazione della proteina esosomi grazie alla rappresentazione incoerente dei livelli della proteina non-exosomal. Il protocollo dettagliato qui è stato sviluppato per rimuovere le proteine non-exosomal che co-purificano con esosomi, aggiunta di rigore per il processo di purificazione di esosomi. Cinque metodi sono stati confrontati usando accoppiato al plasma di sangue e siero da cinque donatori. Analisi usando nanoparticle tracking analysis e analisi della proteina acido bicinconinico micro ha rivelato che un protocollo combinato che utilizza cromatografia di esclusione di ultrafiltrazione e dimensione ha prodotto l’arricchimento della vescicola ottimale e la rimozione di proteina solubile. Macchiarsi occidentale è stato utilizzato per verificare che le proteine del sangue abbondanti attesi, tra cui l’albumina e apolipoproteine, sono state vuotate.
Introduction
Gli esosomi sono nanovesicles (che variano nel formato da 30 nm a 150 nm) rilasciato da quasi tutte le cellule nel corpo umano per facilitare la comunicazione cellula–cellula elabora1,2. È interessante notare che, la composizione degli esosomi cambia a seconda le celle di origine, nonché lo stato di salute dei singoli3,4,5. Inoltre, esosomi possono essere Estratto da diversi fluidi biologici come: saliva, urina e sangue2. A causa di queste caratteristiche, gli esosomi sono considerati una buona fonte di biomarker di malattia. Purtroppo, non esiste alcun metodo standard per l’isolamento di esosomi. Alcuni laboratori considerano centrifugazione multifasico, con un passaggio ad alta velocità finale a 100.000 x g usando le pendenze di densità come il metodo gold standard per l’isolamento di esosomi. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che ultracentrifugazione induce l’aggregazione di esosomi con proteine solubili e altri esosomi, oltre ad interessare l’integrità di esosomi, entrambi i quali possono ostacolare applicazioni a valle6,7 . Altri metodi comuni di esosomi isolamento includono, ma non sono limitati a: precipitazione da commerciale polietilenglicole (PEG) base di reagenti, ultrafiltrazione centrifuga e cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). I reagenti commerciali utilizzando polimeri di polietilene glicole (spina) arricchiscono esosomi causando loro di precipitare e formare una pallina. Limitazioni di utilizzo di questo polimero sono contaminazione con residui PEG polimero e un’abbondanza di proteine solubili non-exosomal nel prodotto finale. Ultrafiltrazione utilizza centrifugazione per purificare e concentrare le vescicole utilizzando una membrana di cellulosa; esosomi vengono mantenuti sopra il filtro, mentre le più piccole impurità e altre proteine passano attraverso la membrana7,8. Proprio come altri metodi, ultrafiltrazione centrifuga ha una capacità limitata per purificare gli esosomi a causa della ritenzione di alti livelli di proteine non-exosomal, tra cui aggregati e complessi proteici. Infine, purificazione SEC utilizza resina porosa per separare le molecole di dimensioni. SEC ha mostrato risultati promettenti, superando la maggior parte dei problemi con esperienza con altri metodi catturando la maggior parte delle proteine contaminanti e preservando l’integrità del exosomal, poiché l’isolamento è basato sulla gravità o sistemi a bassa pressione7, 9. Tuttavia, la co-isolamento di proteine più grandi aggregati e lipoproteine10 durante il SEC colpisce la purezza della preparazione finale esosomi. Mentre alcuni metodi sono stati testati per la purificazione di esosomi da surnatanti della cultura delle cellule e del plasma7o solo al plasma9,11, non c’è alcuna informazione circa le prestazioni dei metodi direttamente a confronto sangue plasma e siero dallo stesso individuo.
Qui, ci concentriamo sulla purificazione del sangue esosomi confrontando una serie di flussi di lavoro per determinare se tecniche di arricchimento della vescicola sono traducibili tra plasma e siero. Nanoparticle tracking analysis e western blot sono stati usati per quantificare le differenze nella composizione di concentrazione, purezza e proteina di esosomi nei prodotti finali. Il metodo finale, dettagliato nel presente protocollo, aumenta i numeri della vescicola e riduce i livelli di proteina non-exosomal. D’importanza, è dimostrata una drastica riduzione delle proteine co-precipitazione comuni tra cui albumina e apolipoproteine. All’abbondanza di queste due proteine nel sangue e la frequenza alla quale essi co-purificare con esosomi cause incoerenze tra i campioni “purificati”, inclinare le analisi a valle. Questo protocollo prevede l’utilizzo di una resina SEC disponibile in commercio; la resina è composto dei branelli porosi in cui proteine inferiore a 700 kDa possono inserire le perline. Una volta all’interno, le proteine vengono mantenute da un ligando octylamine. L’eluato è composto di esosomi e molecole più grandi di 700 kDa12. Inoltre, al fine di ridurre gli aggregati proteici e apolipoproteine che eludere intrappolamento della perla, includiamo una fase di digestione della proteasi del flusso di lavoro. Attualmente, non esiste nessuna tecnica da sola in grado di massimizzare la resa di esosomi riducendo proteine non-exosomal co-purificante. Questo studio indica che un protocollo di purificazione che combina un pretrattamento di digestione della proteasi con più metodi di recupero e purificazione può essere utilizzato per aumentare la resa di esosomi e purezza da siero del sangue e del plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un metodo ottimizzato per aumentare la purezza e la resa degli esosomi da sangue aumenterà la capacità di miniera con precisione le vescicole extracellulari come fonte di biomarcatori per parecchie malattie. I metodi standard attualmente utilizzate per isolare gli esosomi, in particolare, ultracentrifugazione e metodi di precipitazione, hanno diversi svantaggi tra cui aggregazione esosomi e cubettatura di proteine solubili7,17, 18<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da fondi interni da CSU (di KMD), ATCC contratto n. 2016-0550-0002 (un subappalto di NIAID HHSN272201600013C) e The Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (a KMD/NKG). Ringraziamo l’esperienza di ricerca NSF per programma estivo di laureandi (REU) presso la Colorado State University per ulteriore supporto.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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