단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하
Summary
여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.
Abstract
Exosomes, nanovesicle, 모든 세포 유형에 서 발표의 형식 어떤 신체 유체에서 격리 될 수 있습니다. Exosomes, RNAs, 단백질 등의 내용에서 그들이 파생 되 고 질병의 지시자로 사용 될 수 있는 셀에 독특합니다. Ultracentrifugation를 포함 하 여 몇 가지 일반적인 농축 프로토콜 exosomes 수용 성 단백질 오염 물질와 라덴 항복. 특히, 우리는 발견 혈액 내에서 가장 풍부한 단백질 종종 공동 exosomes와 정화와 다운스트림 proteomic 연구, 혼동 수 있습니다 낮은 풍부한 바이오 마커 후보 식별을 방해. 추가적인 관심사의 비 exosomal 단백질 레벨의 일관성 없는 표현으로 인해 exosome 단백질 정량화의 irreproducibility가입니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 공동 exosome 정화 과정을 엄 함 추가, exosomes 함께 정화 비 exosomal 단백질 제거 개발 되었다. 5 개의 메서드 쌍된 혈액 플라스마 및 5 기증자에서 혈 청을 사용 하 여 비교 되었다. 나노 분석 및 마이크로 bicinchoninic 산 성 단백질 분석 결과 추적을 사용 하 여 분석 결합된 프로토콜 적용 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용 하 여 최적의 소포 농축 및 수용 성 단백질 제거 나왔고 밝혔다. 서 부 럽 확인 예상된 풍부한 혈액 단백질, 알 부 민 및 apolipoproteins를 포함 하 여 고갈 되었다 사용 되었다.
Introduction
Exosomes는 nanovesicles (30에서 크기에 이르기까지 150 nm nm)1,2처리 셀을 통신을 용이 하 게 하는 인체에 거의 모든 세포에 의해 발표. 흥미롭게도, exosomes의 구성 원본 셀 뿐만 아니라 개별3,,45의 건강 상태에 따라 변경합니다. 또한, exosomes에서에서 검색할 수 있습니다 여러 가지 생물 학적 체액과 같은: 타 액, 소변, 혈액2. 이러한 기능 때문에 exosomes 질병 biomarkers의 좋은 원천이 될 여겨진다. 불행히도, exosomes의 격리에 대 한 표준 방법이입니다. 일부 실험실 exosome 격리에 대 한 표준 방법으로 밀도 그라디언트를 사용 하 여 100000 x g에서 최종 고속 단계 다단계 원심 분리를 고려 합니다. 그러나, 최근 연구는 ultracentrifugation exosomes 수용 성 단백질 및 exosome 무결성, 다운스트림 응용 프로그램6,7 방해 수 있습니다 둘 다에 영향을 미치는 이외에 다른 exosomes의 유도 . Exosome 고립의 다른 일반적인 방법 포함, 하지만 제한 되지 않는다: 상업적인 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 강 수 기반으로 시 약, 원심 외, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC). 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 고분자를 사용 하 여 상업용 시 약 그들 침전 한 펠 릿을 형성 하 여 exosomes을 풍부. 이 폴리머를 사용 하 여 제한 잔여 말뚝 폴리머와 최종 제품에 수용 성 비 exosomal 단백질의 풍부한 오염 있습니다. 한 원심 하 정화 하 고 셀 룰 로스 막;를 사용 하 여 소포를 집중 활용 exosomes는 필터 위에 작은 불순물 및 다른 단백질 막7,8을 통과 하는 동안 유지 됩니다. 다른 방법 처럼 원심 한 정화 exosomes의 비 exosomal 단백질, 단백질 복합물 및 집계를 포함 하 여 높은 수준의 보존 때문에 제한 된 용량을 하고있다. 마지막으로, 초 정화 분자 크기 별로 분리를 다공성 수 지를 사용 합니다. 초 오염 물질 단백질의 대부분을 캡처하고 중력 또는 저압 시스템7,를 기반으로 하는 고립 exosomal 무결성을 보존 하 여 다른 방법으로 경험이 문제의 대부분을 극복 하는 유망한 결과 보이고 있다 9. 그러나, 초 동안 더 큰 단백질 집계 및 단백질10 의 공동 격리 최종 exosome 준비의 순수성을 영향을 줍니다. 몇 가지 방법이 세포 문화 supernatants 및 플라즈마7, 또는 플라즈마9,11exosome 정화에 대 한 테스트 되었습니다, 혈액을 직접 비교 하는 방법의 성능에 대 한 정보는 플라즈마와 같은 개인에서 혈 청
여기, 우리는 다양 한 소포 농축 기술 플라즈마와 세럼 사이 번역 확인 하려면 워크플로 비교 하 여 exosomes 혈액의 정화에 초점. 나노 분석 및 서쪽 오 점 추적 exosome 농도, 순도, 단백질 구성 최종 제품에서의 차이 척도를 사용 했다. 마지막 방법은,이 프로토콜에 대 한 자세한 소포 번호를 증가 하 고 비 exosomal 단백질 수준을 감소 시킨다. 중요 한 것은, 일반적인 공동 계기 단백질 알 부 민 및 apolipoproteins 등의 급격 한 감소는 보여 줍니다. 피 고는 그들은 공동 정화 exosomes와 다운스트림 분석 기울이기 “순화” 샘플 간의 원인 불일치 하는 주파수에이 두 가지 단백질의 높은 풍부. 이 프로토콜은 상업적으로 사용할 수 있는 초 수 지;의 사용을 포함 수 지는 다공성 구슬 단백질 700 kDa 보다 작은 구슬을 입력할 수 있습니다 구성 된다. 한 번 안쪽으로, 단백질 octylamine 리간드에 의해 유지 됩니다. Exosomes와 700 kDa12보다 큰 분자는 eluate 구성 됩니다. 또한, 단백질 집계 및 구슬 트랩을 피하기 위해 apolipoproteins을 줄이기 위해 우리는 워크플로의 효소 소화 단계는. 현재, 공동 정화 비 exosomal 단백질을 줄이면서 exosome 수익률을 극대화 할 수 없는 하나의 기술이입니다. 이 연구는 여러 복구 및 정화 방법 효소 소화 전처리를 결합 하는 정화 프로토콜 exosome 수율 및 순도 혈액 혈 청 및 혈장에서 증가 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
순도 및 혈액에서 exosomes의 수확량을 증가 하는 최적화 된 방법 정확 하 게 여러 가지 질병에 대 한 생체의 원천으로 extracellular 소포 내 능력을 증가할 것 이다. 표준 방법 현재 exosomes, 특히, 분리 하는 데 사용 ultracentrifugation과 강 수 방법, exosome 집계 및 수용 성 단백질7,,17판 몇 가지 단점이 있다 18. 또는, SEC의 사용 exosome 격리,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 (KMD/NKG)에 CSU (KMD)를, ATCC 계약 #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C의 하청), 그리고 법안과 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1039688)에서 내부 자금에 의해 지원 되었다. 우리는 추가 지원에 대 한 콜로라도 주립 대학에서 학부생 (소장) 여름 프로그램에 대 한 NSF 연구 경험 감사합니다.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
