Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки
Summary
Здесь мы представляем протокол для очистки exosomes из плазмы и сыворотки с сокращением Сопредседатель очистки белков крови не exosomal. Оптимизированный протокол включает ультрафильтрации, лечение протеазы и размер гель-проникающей хроматографии. Расширение очистки exosomes преимущества течению анализов, включая более точной количественной оценки везикулы и протеомных характеристика.
Abstract
Exosomes, тип nanovesicle, освобожден от всех типов клеток, могут быть изолированы от любых телесных жидкости. Содержание exosomes, в том числе белков и РНК, являются уникальными для клетки, от которых они наследуются и может использоваться как показатели заболевания. Несколько общих протоколов обогащения, включая ultracentrifugation, выход exosomes, нагруженные белковых загрязнений. Конкретно мы нашли что самые обильные белков в крови часто совместно очищают с exosomes и может посрамить течению протеомических исследований, срыве выявление низкой изобилие биомаркера кандидатов. Дополнительную обеспокоенность является невоспроизводимость exosome белка количественной оценки из-за несовместимых представление уровня белка не exosomal. Чтобы удалить не exosomal белки, которые совместно очищают наряду с exosomes, добавление строгость в процессе очистки exosome был разработан протокол, подробно здесь. Пять методов были сопоставлены с помощью парных плазмы крови и сыворотки из пяти доноров. С помощью наночастиц, отслеживания, анализа и микро bicinchoninic кислоты белка пробирного анализа показали, что сводный протокол, используя ультрафильтрации и размер гель-проникающей хроматографии принесли оптимальный везикул обогащения и удаления растворимого белка. Западный blotting использовался для проверки, что ожидаемые обильные крови белков, в том числе альбумина и аполипопротеинов, были истощены.
Introduction
Exosomes являются nanovesicles (размером от 30 Нм до 150 Нм) выпустила почти всех клеток в организме человека для облегчения связи в ячейке обрабатывает1,2. Интересно, что состав exosomes изменяется в зависимости от клетки происхождения, а также состояние здоровья отдельных3,4,5. Кроме того, exosomes могут быть получены из нескольких биологических жидкостей, таких как: слюна, моча и крови2. Из-за этих особенностей exosomes считаются хорошим источником болезни биомаркеров. К сожалению это не стандартный метод для изоляции exosomes. Некоторые лаборатории считают многоступенчатое центрифугирования, с последним высокоскоростной шагом на 100,000 x g с помощью градиентов плотности как метод золотой стандарт для exosome изоляции. Однако недавние исследования показали, что ultracentrifugation индуцирует агрегацию exosomes с растворимые белки и другие exosomes, в дополнение к затрагивающим целостность exosome, оба из которых могут препятствовать нисходящие приложения6,7 . Другие распространенные методы изоляции exosome включают, но не ограничиваются: количество осадков в коммерческих полиэтиленгликоля (PEG) на основе реагентов, центробежные ультрафильтрации и размер-гель-проникающей хроматографии (SEC). Коммерческих реактивов, с помощью полиэтиленгликоля (PEG) полимеров обогатить exosomes, заставляя их осадка и форма гранул. Ограничения, используя этот полимер являются загрязнение с остаточной PEG полимера и обилие растворимых не exosomal белков в конечный продукт. Ультрафильтрация использует центрифугирования для очищения и сконцентрировать пузырьки с помощью мембраны целлюлозы; exosomes сохраняются выше фильтр, в то время как меньше примесей и другие белки проходят через мембрану7,8. Так же, как другие методы центробежные ультрафильтрации имеет ограниченные возможности для очистки exosomes из-за сохранения высокого уровня не exosomal белков, белковых комплексов и агрегатов. Наконец SEC очистки использует пористых смолы для разделения молекул по размеру. SEC показал многообещающие результаты, преодоление большую часть проблем, возникших с другими методами, захватив часть загрязнений белков и сохранения целостности exosomal, так как изоляция основан на гравитации или низкого давления системы7, 9. Однако, Сопредседатель изоляции больше белка агрегатов и липопротеинов10 во время SEC влияет на чистоту подготовки окончательного exosome. Хотя некоторые методы были протестированы для exosome очистки от supernatants культуры клеток и плазмы7или только плазмы9,11, нет никакой информации о производительности методов прямого сопоставления крови плазмы и сыворотки от того же лица.
Здесь мы сосредоточены на очищение крови exosomes путем сравнения различных рабочих процессов, чтобы определить, если методы обогащения везикул переводимых между плазмой и сыворотки. Наночастицы, отслеживания, анализа и Западная помарка были использованы для количественного определения различий в составе концентрации, чистоты и белка exosome в конечных продуктах. Последний метод, подробно изложены в настоящем Протоколе, увеличение числа везикул и уменьшает уровни белка не exosomal. Важно отметить, что свидетельствует резкое сокращение общего совместного осаждения белков, включая альбумин и аполипопротеинов. Высокое обилие этих двух белков в крови и частота, с которой они совместно очищают с exosomes причины несоответствия между «очищенного» образцы, наклон вниз по течению анализы. Этот протокол включает в себя использование коммерчески доступных SEC смолы; смола состоит из пористых бусы, в которых меньше чем 700 кДа белками можно ввести бисер. Раз внутри, белки удерживаются octylamine лиганда. Элюата состоит из exosomes и больше чем 700 кДа12молекул. Кроме того для того, чтобы уменьшить белка агрегатов и аполипопротеинов, который уклониться от шарик треппинга, мы включать протеазы пищеварение шаг в рабочем процессе. В настоящее время не способен ни один метод максимального exosome доходности при одновременном снижении совместно очистки белков не exosomal. Это исследование показывает, что протокол очистки, который сочетает в себе протеазы пищеварение предварительной обработки с нескольких методов очистки и восстановления может использоваться для увеличения урожайности exosome и чистоты из сыворотки крови и плазмы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимизированный метод для повышения чистоты и доходность exosomes из крови будет увеличить способность точно шахта внеклеточного везикулы как источник биомаркеров для ряда заболеваний. Стандартные методы в настоящее время используется для изоляции exosomes, в частности, ultracentrifugation и методы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано внутренних средств от CSU (чтобы КМД), ATCC контракт #2016-0550-0002 (субподряда NIAID HHSN272201600013C) и Фонд Билла и Мелинды Гейтс (OPP1039688) (КМД/НКГ). Мы благодарим NSF исследовательский опыт для студентов (REU) летняя программа в университете штата Колорадо для дополнительной поддержки.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
