Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para purificar exosomas de plasma y suero con menor Co purificación de proteínas de la sangre no exosomal. El protocolo optimizado incluye tratamiento con proteasas y ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Mayor purificación de exosomas beneficios aguas abajo los análisis, incluyendo la cuantificación más exacta de las vesículas y caracterización proteómica.
Abstract
Exosomas, un tipo de nanovesicle liberado de todos los tipos de célula, pueden ser aislado de cualquier líquido corporal. El contenido de exosomas, incluyendo proteínas y ARN, es único a las células que se derivan y pueden ser utilizados como indicadores de enfermedad. Varios protocolos de enriquecimiento común, como la ultracentrifugación, producen exosomas cargado de contaminantes de la proteína soluble. Específicamente, hemos encontrado que las proteínas más abundantes en la sangre a menudo Co purifican con exosomas y pueden confundir los estudios proteómicos aguas abajo, frustrando la identificación de candidatos de biomarcadores de baja abundancia. De preocupación adicional es irreproducible de exosomas cuantificación de proteína debido a representación incompatible de niveles de proteína no-exosomal. El protocolo detallado aquí fue desarrollado para eliminar las proteínas no exosomal que co purifican junto con exosomas, adición de rigor en el proceso de purificación de exosomas. Cinco métodos se compararon mediante pares plasma de sangre y suero de cinco donantes. Análisis usando nanopartículas de seguimiento análisis y ensayo de proteína ácido bicinchoninic micro reveló que un protocolo combinado utilizando cromatografía por exclusión de tamaño y ultrafiltración dio como resultado el enriquecimiento óptima de la vesícula y la eliminación de la proteína soluble. Western Blot se utilizó para verificar que las proteínas de la sangre abundante esperados, incluyendo albúmina y Apolipoproteínas, estaban agotadas.
Introduction
Exosomas son Nanovesículas (que varían en tamaño desde 30 nm y 150 nm) facilitar la comunicación de célula a célula por casi todas las células en el cuerpo humano procesa1,2. Curiosamente, la composición de los exosomas cambia dependiendo de las células de origen, así como el estado de salud del individuo3,4,5. Además, exosomas pueden ser obtenido de varios fluidos biológicos tales como: saliva, orina y sangre2. Debido a estas características, exosomas se consideran una buena fuente de biomarcadores de la enfermedad. Desafortunadamente, no existe ningún método estándar para el aislamiento de exosomas. Algunos laboratorios consideran varios pasos centrifugación, con un paso de alta velocidad final a 100.000 x g utilizando gradientes de densidad como el método estándar de oro para el aislamiento de exosomas. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que ultracentrifugación induce la agregación de los exosomas con proteínas solubles y otras exosomas, además afectando la integridad de exosomas, que pueden obstaculizar las aplicaciones de bajada6,7 . Otros métodos de aislamiento de exosomas comunes incluyen, pero no se limitan a: precipitación por comercial polietilenglicol (PEG) basado en reactivos, centrífuga ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Los reactivos comerciales usando polímeros de polietilenglicol (PEG) enriquecen exosomas por haciéndolos precipitar y formar una pelotilla. Limitaciones de uso de este polímero son la contaminación con residuales polímeros de PEG y la abundancia de proteínas solubles no exosomal en el producto final. Ultrafiltración utiliza centrifugación para purificar y concentrar las vesículas con membrana de celulosa; exosomas se mantienen por encima del filtro, mientras que las impurezas más pequeñas y otras proteínas atraviesan la membrana7,8. Al igual que otros métodos de ultrafiltración centrífuga tiene una capacidad limitada para purificar exosomas debido a la retención de altos niveles de proteínas no exosomal, incluyendo agregados y complejos de la proteína. Por último, purificación seg utiliza resina porosa para separar moléculas por tamaño. SEC ha demostrado resultados prometedores, superar la mayoría de los problemas experimentados con otros métodos de captura de la mayoría de las proteínas contaminantes y preservar la integridad de la exosomal, puesto que el aislamiento se basa en la gravedad o sistemas de baja presión7, 9. Sin embargo, el aislamiento Co de mayor proteína agregados y lipoproteínas10 durante SEC afecta la pureza de la preparación final de exosomas. Mientras que algunos métodos han sido probados para la purificación de exosomas de sobrenadantes de cultivo de células y plasma7o9,de plasma solamente11, no hay información sobre el desempeño de métodos comparando directamente la sangre plasma y el suero del individuo mismo.
Aquí, nos centramos en la purificación de la sangre exosomas comparando una variedad de flujos de trabajo para determinar si las técnicas de enriquecimiento vesícula son traducibles entre plasma y suero. Nanopartículas de seguimiento análisis y western blot fueron utilizados para cuantificar las diferencias en la composición de proteína, concentración y pureza de exosomas en los productos finales. El método final, detallado en el presente Protocolo, aumenta el número de vesículas y reduce los niveles de proteína no-exosomal. Lo importante, se demostró una reducción drástica de común Co precipitando proteínas como albúmina y Apolipoproteínas. La gran abundancia de estas dos proteínas en sangre y la frecuencia en que co purifican con exosomas causas inconsistencias entre las muestras “purificadas”, sesgando el análisis descendentes. Este protocolo incluye el uso de una resina de s disponible en el mercado; la resina se compone de granos porosos en que las proteínas menores de 700 kDa pueden introducir los granos. Una vez dentro, las proteínas son retenidas por un ligando Octilamina. El eluido se compone de exosomas y moléculas más grandes que 700 kDa12. Además, con el fin de reducir los agregados de proteínas y Apolipoproteínas que evaden captura de grano, se incluye un paso de digestión de proteasa en el flujo de trabajo. Actualmente, no es capaz de maximizar el rendimiento de exosomas reduciendo el co purificación proteínas no exosomal solo técnica. Este estudio muestra que un protocolo de purificación que combina un tratamiento previo de digestión de proteasa con varios métodos de recuperación y purificación puede usarse para aumentar el rendimiento de exosomas y pureza del suero sanguíneo y plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un método optimizado para aumentar la pureza y rendimiento de exosomas de sangre aumentará la capacidad de mina con precisión las vesículas extracelulares como fuente de biomarcadores para varias enfermedades. Los métodos estándar actualmente utilizados para aislar exosomas, específicamente, ultracentrifugación y métodos de precipitación, tienen varias desventajas incluyendo agregación de exosomas y granulación de proteínas solubles7,17, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por fondos internos del CSU (a KMD), ATCC contrato #2016-0550-0002 (un subcontrato de NIAID HHSN272201600013C) y la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1039688) (a KMD/recuperación). Agradecemos a la experiencia de investigación NSF para programa de verano de estudiantes universitarios (REU) en la Universidad Estatal de Colorado para soporte adicional.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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