단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

요약

여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.

초록

Exosomes, nanovesicle, 모든 세포 유형에 서 발표의 형식 어떤 신체 유체에서 격리 될 수 있습니다. Exosomes, RNAs, 단백질 등의 내용에서 그들이 파생 되 고 질병의 지시자로 사용 될 수 있는 셀에 독특합니다. Ultracentrifugation를 포함 하 여 몇 가지 일반적인 농축 프로토콜 exosomes 수용 성 단백질 오염 물질와 라덴 항복. 특히, 우리는 발견 혈액 내에서 가장 풍부한 단백질 종종 공동 exosomes와 정화와 다운스트림 proteomic 연구, 혼동 수 있습니다 낮은 풍부한 바이오 마커 후보 식별을 방해. 추가적인 관심사의 비 exosomal 단백질 레벨의 일관성 없는 표현으로 인해 exosome 단백질 정량화의 irreproducibility가입니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 공동 exosome 정화 과정을 엄 함 추가, exosomes 함께 정화 비 exosomal 단백질 제거 개발 되었다. 5 개의 메서드 쌍된 혈액 플라스마 및 5 기증자에서 혈 청을 사용 하 여 비교 되었다. 나노 분석 및 마이크로 bicinchoninic 산 성 단백질 분석 결과 추적을 사용 하 여 분석 결합된 프로토콜 적용 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용 하 여 최적의 소포 농축 및 수용 성 단백질 제거 나왔고 밝혔다. 서 부 럽 확인 예상된 풍부한 혈액 단백질, 알 부 민 및 apolipoproteins를 포함 하 여 고갈 되었다 사용 되었다.

서론

Exosomes는 nanovesicles (30에서 크기에 이르기까지 150 nm nm)^1,2처리 셀을 통신을 용이 하 게 하는 인체에 거의 모든 세포에 의해 발표. 흥미롭게도, exosomes의 구성 원본 셀 뿐만 아니라 개별^3,,45의 건강 상태에 따라 변경합니다. 또한, exosomes에서에서 검색할 수 있습니다 여러 가지 생물 학적 체액과 같은: 타 액, 소변, 혈액². 이러한 기능 때문에 exosomes 질병 biomarkers의 좋은 원천이 될 여겨진다. 불행히도, exosomes의 격리에 대 한 표준 방법이입니다. 일부 실험실 exosome 격리에 대 한 표준 방법으로 밀도 그라디언트를 사용 하 여 100000 x g에서 최종 고속 단계 다단계 원심 분리를 고려 합니다. 그러나, 최근 연구는 ultracentrifugation exosomes 수용 성 단백질 및 exosome 무결성, 다운스트림 응용 프로그램^6,

프로토콜

이 작품을 결정 했다 하지 인간의 주제 연구 초기 검토에서 콜로라도 주립 대학의 기관 검토 위원회 (IRB), 모든 인간의 샘플 Bioreclamation IVT biorepository에서 취소 확인 된 견본으로 가져온 고 했다 IRB 승인 프로토콜에서 수집.

1. 산 큰 소포 및 세포질 파편에 의해 원유 샘플 (플라스마 또는 혈 청)의 준비

참고: 안전 고려 사항: 플라스마, 혈 청, 그리고 다른 생물 학적 체액 유해 재료 이며 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 기본적인 개인 보호 장비를 착용 하는 동안 특별 한 관리와 처리 해야 합니다. 생물 학적 샘플 biosafety 내각;에서 처리 되는 것이 좋습니다. 그렇지 않다면, 눈 보호를 사용 하 여 것이 좋습니다.

1. 4 ° C 냉장고에 하룻밤 떨고 비 조건에서 튜브를 배치 하 여 혈 청 또는 혈장 샘플을 equilibrate (중-20에서 또는-80 ° C).
2. Aliquot 250 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에 샘플의.
3. 4 ° c.에 30 분 18000 x g에서 샘플을 원심
4. 200 µ L....

결과

아래 데이터는 5 명의 건강 한 혈액 기증자 로부터 쌍된 플라스마와 혈 청 샘플을 사용 하 여 얻은 했다. 그리고 각 처리 단계에의 효과 확인 하려면 제시 프로토콜의 5 개의 변형 수행 했다, exosome 복구 및 비 exosome 단백질 제거 비교 했다. 포함 된 메서드 trialed: 1) SEC 700 kDa + 외 3 kDa; 2) 한 100 kDa; 3) 가수분해 K + 외 100 kDa; 4) 초 700 kDa + 외 100 kDa, 및 5) 성분을 K + 외 100 kDa + 초 700 kDa 외 3 kDa.

샨 다, 초 700 kDa (1, 4, 및 5)를 포함 하는 모든 방법 샘플, 혈 청, 그리고 플라즈마 (그림 1A-B)의 두 종류에서 단백질의 그램 당 ves.......

토론

순도 및 혈액에서 exosomes의 수확량을 증가 하는 최적화 된 방법 정확 하 게 여러 가지 질병에 대 한 생체의 원천으로 extracellular 소포 내 능력을 증가할 것 이다. 표준 방법 현재 exosomes, 특히, 분리 하는 데 사용 ultracentrifugation과 강 수 방법, exosome 집계 및 수용 성 단백질^{7,,17판 몇 가지 단점이 있다 18}. 또는, SEC의 사용 exosome 격리, 집계에서 exosomes를 보호 하 고 일반적인 오염 물질 비 exosomal 단백질^9,,1118 의 제거 향상에 상당한 개선을 나타났습니다. ^,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nanosight	Malvern	NS300
벤치탑 마이크로 원심분리기	Thermo	Legend Mico21
벤치탑 원심분리기	벡크만 쿨터	알레그라 6R
워터배스	벤치마크	B2000-4
마이크로플레이트 리더	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA 단백질 분석 키트	THERMO	23227
마이크로 BCA 단백질 분석 키트	THERMO	23235
인산염 완충 식염수	Corning	21-040-CV
96 웰 플레이트	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛 Ultracel-100 막	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 원심 필터 유닛	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE 헬스케어	17548103
Poly-Prep  크로마토그래피 컬럼	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔	THERMO	NP0323BOX
니트로셀룰로오스 멤브레인, 롤, 0.2 &마이크로; m	BIORAD	1620112
단백질분해효소 K,  Tritirachium 앨범	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST  BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 항체 (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary 항체	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	1차 및 2차 항체
ALB 항체 (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	1차 항체
apoB 항체 (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	1차 항체
apoA-I 항체 (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	1차 항체