Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için
Summary
Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.
Abstract
Exosomes, tüm hücre türlerinden serbest nanovesicle bir tür herhangi bir bedensel sıvı ayrılmış olabilir. Protein ve RNA’ların, dahil olmak üzere exosomes, içeriğini benzersiz hücrelere hangi onlar türetilmiştir ve hastalık göstergeleri olarak kullanılabilir. Ultrasantrifüj, birkaç yaygın zenginleştirme iletişim kuralları dahil, çözünür protein kirleticiler ile yüklü exosomes verim. Özellikle, biz kan içinde en bol protein kez exosomes ile birlikte arındırmak ve aşağı akım proteomik çalışmaları, yıkmak düşük bereket biyomarker adaylar tanımlaması engelliyordu bulduk. Ek eksozom protein miktar sigara exosomal protein düzeyleri tutarsız temsil nedeniyle irreproducibility ilgilendirir. Burada ayrıntılı iletişim kuralı ile birlikte exosomes, rigor eksozom arıtma işlemi için ekleme işbirliği arındırmak sigara exosomal proteinler kaldırmak için geliştirilmiştir. Beş yöntem kullanarak eşleştirilmiş kan plazması ve serum beş bağışçılardan karşılaştırıldı. Analiz analizi ve mikro bicinchoninic asit protein tahlil izleme nanopartikül Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi kullanan bir Birleşik iletişim kuralı en iyi vezikül zenginleştirme ve çözünür protein kaldırma verdiğini ortaya koydu. Western Blot albümin ve trigliseritlerin, dahil beklenen bol kan proteinleri tükenmiş doğrulamak için kullanıldı.
Introduction
Exosomes olan nanovesicles (büyüklükleri 30 arasında değişen nm 150 nm) serbest bırakmak yanında insan vücudunun hemen hemen tüm hücrelerde hücre hücre iletişimi kolaylaştırmak için1,2işler. İlginçtir, exosomes bileşimi kökenli hücrelerinin yanı sıra bireysel3,4,5sağlık durumunu bağlı olarak değişir. Ayrıca, exosomes birkaç biyolojik sıvıları gibi alınabilir: tükürük, idrar ve kan2. Bu özelliğinden dolayı exosomes hastalığı biyolojik iyi bir kaynak olarak kabul edilir. Ne yazık ki, işte exosomes yalıtım için standart bir yöntemi yoktur. Bazı laboratuvarlar ile 100.000 x g eksozom yalıtım için altın standart yöntemi olarak yoğunluk gradyanlar kullanarak, son bir yüksek hızlı adım multistep Santrifüjü göz önünde bulundurun. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu ultrasantrifüj toplama çözünür proteinler ile exosomes ve ya bütünlüğü, ikisi de aşağı akım uygulamaları6,7 engel olabilir etkileyen ek olarak diğer exosomes indükler göstermiştir . Ya yalıtım diğer yaygın yöntemler içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir: yağış ticari polietilen glikol (PEG) tarafından reaktifler, santrifüj Ultrafiltrasyon ve boyutu-dışlama Kromatografi (sn) temel alır. Polietilen glikol (PEG) polimerler kullanılarak ticari reaktifler çökelti ve bir Pelet formu onları neden olarak exosomes zenginleştirmek. Bu polimer kullanarak kalan PEG polimer ve çözünür olmayan exosomal proteinler arasında nihai ürün bolluğu ile kirlenme sınırlamalardır. Ultrafiltrasyon arındırmak ve selüloz membran kullanarak veziküller konsantre Santrifüjü kullanır; küçük yabancı maddeleri ve diğer proteinler membran7,8-geçmek iken exosomes filtre korunur. Diğer yöntemler gibi santrifüj Ultrafiltrasyon exosomes sigara exosomal proteinler, protein kompleksleri ve toplamları dahil olmak üzere yüksek düzeyde tutma nedeniyle arındırmak için sınırlı bir kapasiteye sahiptir. Son olarak, sn arıtma gözenekli reçine molekül boyutuna göre ayırmak için kullanır. SN umut verici sonuçlar, diğer yöntemler ile deneyimli sorunların çoğu geçen madde proteinler çoğunluğu yakalayarak ve yalıtım yerçekimi veya alçak basınç sistemleri7göre bu yana exosomal bütünlüğü, koruma üstesinden göstermiştir, 9. Ancak, daha büyük protein toplamları ve lipoproteinler10 eş yalıtım sn sırasında son eksozom hazırlık saflığı etkiler. Bazı yöntemler eksozom arıtma hücre kültür supernatants ve plazma7ya da sadece plazma9,11test edilmiş, orada iken yöntemleri doğrudan kan karşılaştırarak performansı hakkında bilgi yok Plazma ve serum aynı kişiden.
Burada, kan exosomes arınma vezikül zenginleştirme tekniklerini plazma ve serum arasında çevrilebilir özellikte olup olmadığını belirlemek için iş akışları çeşitli karşılaştırarak ele. İzleme analizi ve western blot nanopartikül eksozom konsantrasyon, saflık ve protein kompozisyon içinde son ürün farklılıkları ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol için ayrıntılı son yöntem vezikül numaralarını artırır ve sigara exosomal protein düzeyleri azaltır. Önemlisi, albümin ve trigliseritlerin dahil olmak üzere ortak işbirliği Hizlandirici proteinlerin sert bir düşüş gösterdi. Bu iki protein kan ve hangi onlar exosomes ile aşağı akım analizleri eğriltme “saf” örnekleri arasında neden tutarsızlıklar co arındırmak frekans yüksek bolluk. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan sn reçine kullanımını içerir; reçine proteinler 700 kDa küçük boncuklar girebileceği gözenekli boncuk oluşur. Bir kez içinde proteinler bir octylamine ligand tarafından korunur. Eluate exosomes ve 700 kDa12‘ den daha büyük moleküllerin oluşur. Ayrıca, protein toplamları ve boncuk bindirme kaçmasına trigliseritlerin azaltmak için biz bir proteaz sindirim adım iş akışı içinde dahil. Şu anda, ortak arındırıcı sigara exosomal proteinler azaltırken eksozom verim maksimize yeteneğine sahip tek hiçbir tekniği yoktur. Bu çalışmada bir proteaz sindirim Önarıtma birden fazla kurtarma ve arıtma yöntemleri ile birleştirir bir arıtma protokol eksozom verim ve saflık kan serumu ve plazma artırmak için kullanılabileceğini gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Saflık ve exosomes kandan verimini artırmak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem doğru bir şekilde biyolojik çeşitli hastalıklar için bir kaynak olarak ekstrasellüler veziküller benim yeteneği artacaktır. Şu anda exosomes, özellikle, izole etmek için kullanılan standart yöntemler ultrasantrifüj ve yağış yöntemleri, çözünür proteinler7/,17, peletleme ve eksozom toplama dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları var <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma iç fonların CSU (KMD için) ATCC sözleşme #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C bir taşeron) ve Bill ve Melinda Gates Vakfı (OPP1039688) (KMD/NKG) tarafından desteklenmiştir. NSF araştırma deneyimi Colorado State Üniversitesi’nde lisans (REU) yaz programı için ek destek için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
