Brug af Anti-phospho-girdin antistoffer til at visualisere Intestinal Tuft celler i frit svævende musen Jejunum snit frosset organmateriale

Summary

Kuga et al. opdagede at fosforylering-status specifikke antistoffer mod den actin bindende protein girdin fosforyleret på tyrosin 1798 (pY1798) kan bruges til at mærke tuft celler (TCs). Denne protokol giver mulighed for robust visualisering af FKS bruger immunfluorescent farvning af frit svævende jejunum snit frosset organmateriale med pY1798 antistoffer.

Abstract

Aktin bindende protein girdin er en cytosole protein, der er påkrævet til aktin remodeling for at udløse celle migration i forskellige væv. Girdin er fosforyleret af både receptor og ikke-receptor tyrosin kinaser på tyrosin 1798. Omori et al. udviklet websted- og fosforylering status-specifikke antistoffer mod menneskelige girdin på tyrosin-1798 (pY1798), der specifikt binder til fosforyleres tyrosin-1798, men ikke til unphosphorylated tyrosin-1798. pY1798 antistoffer har været brugt specielt mærke tuft celler (FKS), der er til stede i pattedyr gastrointestinale væv, men funktionen af disse celler er uklart. Denne protokol giver mulighed for robust visualisering af TCs i jejunum ved hjælp af pY1798 antistoffer og immunfluorescens. For at sikre en vellykket og enkel TC visualisering, denne protokol omfatter to histologiske teknikker: produktion af frit svævende snit frosset organmateriale fra gelatine-fyldt jejunum væv og lav temperatur antigen hentning ved 50 ° C til 3 h. påfyldning jejunum med gelatine bevarer formen af frit svævende sektioner i hele proceduren farvning lav temperatur antigen hentning sikrer robust signaler fra TCs. vellykket anvendelse af denne protokol resulterer i pY1798 farvning af FKS distribueres fra villus tip til krypt. Farvede FKS har en spool-formet soma og fluorescerende signaler kondensere på den lumenal spids, som svarer til den fremspringende «tuft.» Phalloidin farvning colocalized med pY1798-positive TCs på grænsen fortykket børste, og svarer til en rootlet masse strækker sig fra TC TOT. Denne protokol kan bruges til at undersøge TCs i menneskelige biopsi prøver indsamles med gastrointestinal endoskoper. Derudover blev FKS for nylig rapporteret at akkumulere efter parasit infektion i mus, tyder på, at denne protokol kan have programmer til diagnosticering af parasitinfektioner i human tarmen.

Introduction

Tuft celler (TCs) er mindre spredte bestanddele af gastrointestinale epitheler, der er karakteriseret ved apikale totter og spool-formet svovldepositioner¹. Selvom FKS blev første gang beskrevet i 1956², forbliver TC funktion uklart, delvis på grund af mangel på pålidelige TC markører.

Enomoto et al. først karakteriseret actin bindende protein girdin³, som er udtrykt i nervesystemet og i ikke-neurale væv såsom blodkar, hjerteklapper, sener og skeletmuskulatur⁴. Mus med genetiske ablation af girdin vise væksthæmning og flere hjernen anomalier^4,5,6. I mellemtiden, tab af funktion mutation i menneskets girdin er forbundet med progressiv encephalopati, svær retardering og tidligt indsættende epileptiske anfald⁷.

I 2011 identificeres Lin et al. dynamisk fosforylering af girdin på tyrosin 1798 medieret af tyrosin kinaser som EGFR og Src⁸. De viste også, at fosforyleres girdin kræves til aktin remodeling for at udløse celle migration⁸. Omori et al. udviklet websted – og fosforylering status-specifikke antistoffer mod menneskelige girdin fosforyleret på tyrosin 1798 (pY1798 antistoffer) efter Goto protokollen, og validerede antistoffer ved hjælp af site-directed mutagenese af udtrykket vektorer regnskabsmæssige fuld længde girdin^9,10. I 2017, Kuga et al. rapporterede, at pY1798 etiketter FKS med høj specificitet og høj følsomhed¹. PY1798 antistoffer var vist sig at være overlegen i forhold til tidligere TC markører baseret på fremragende farvning egenskaber, der afslørede figuren hele cellen, herunder karakteristiske ‘tuft’ lumenal spids, endnu den biologiske rolle girdin og phospho-girdin i TC funktionen forblev uklare¹.

Metoden i denne undersøgelse indebærer immunofluorescens farvning, en histologisk teknik til at markere et specifikt protein på væv ved hjælp af en primære antistof mod et mål protein og et fluorescens-konjugeret sekundær antistof mod primære antistof. Formålet med denne metode er at give forskere med begrænset histologiske erfaring at opnå høj kvalitet TC billeder. Denne protokol bruger frit svævende snit frosset organmateriale, som undgår behovet for dias-monteret snit frosset organmateriale, eller paraffin afsnit. Imidlertid frit svævende sektioner er sårbare på grund af manglende støtte fra et glas dias og snittykkelsen kan mindske antistof permeabilitet. Denne protokol omfatter to tilgange, at overvinde disse spørgsmål: 1) fylde hele jejunum lumen med gelatine at bevare morfologi af frit svævende sektioner i hele de farvning procedurer, og 2) brug af lav-temperatur antigen hentning til intensivere pY1798 signaler.

Protocol

Alle metoder, der beskrives her blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget af instituttet for Developmental forskning, Aichi Human Service Center (ansøgningsnummer: M-03). 1. præparater Forberede 10 L af fosfatbufferet saltopløsning (PBS): 32.27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g NaH2PO4·2H2O, 80.0 g NaCl tilsættes ultrarent vand til endelige mængden af 10 L. butik opløsning ved stuetemperatur (RT). Forberede 200 mL PBS-T: 200 mL PBS fra trin 1.1 med 100 µL af polyoxyethylene(10) octylphenyl ether til en endelig koncentration på 0,05% (vol:vol). Butik på RT. Mens iført handsker og øjenbeskyttelse, forberede 50 mL af 15% saccharose i 10% “buffered” neutral formalin løsning: 7,5 g saccharose tilføjes 10% “buffered” neutral formalin løsning (Table of Materials) til en endelige rumfang paa 50 mL. Butik på RT.Forsigtig: Indånding og/eller hud/øje kontakt med formaldehyd i 10% “buffered” neutral formalin løsning kan være farlige. Behandles med forsigtighed. Forberede 1,5 mL 200 enheder/mL phalloidin-fluorescerende farvestof konjugat stamopløsning: phalloidin-fluorescerende farvestof konjugat (300 enheder i 1 hætteglas, frysetørrede legemer, excitations- og bølgelængder: 581 nm og 609 nm, henholdsvis) suspenderet i 1,5 mL methanol. Gemme løsning i mørke ved-20 ° C. Forberede 5 mg / mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorid (DAPI) bestand løsning: 10 mg af DAPI i N, N-dimethylformamid (DMF) sættes 2 mL. Gemme løsning i mørke ved-20 ° C. Forberede 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS: 0,5 g BSA, 10 mL PBS. Opbevares ved 4 ° C. Fjerne den skrå spids af en 18-gauge lige nål ved hjælp af en nipper, og klemme den frostsvedne ende med en pincher i en langsgående retning at give væske til at flyde gennem nålen lumen (figur 1A1).Bemærk: Protokollen kan pause her. 2. animalske dissektion og Isolation af Jejunum Perfusion fiksering af en mus Bære handsker og arbejde i et godt ventileret område. Forberede et 100 mL glas bægerglas, 10% “buffered” neutral formalin løsning, kirurgiske værktøjer (saks, pincet), en metallisk bakke, 6-0 nylon skære suturer, en 18-gauge lige nål parat som 1.7, en 22-gauge vingede nål, en 20-mL sprøjte. Indlæse 20 mL 10% “buffered” neutral formalin løsning fra glas bægerglas i 20-mL sprøjte, og vedhæfte den 22-gauge vingede nål til stikkontakten. Forbered flydende gelatine ved at tilføje 1 g gelatine pulver til 20 mL PBS (sidste 5% gelatine) i et 50 mL-centrifugerør. Efter iblødsætning på RT for 15 min, inkuberes ved 50 ° C i et vandbad i 15 min uden rystelser. Kort vortexes og inkuberes ved 50 ° C i en anden 15 min til at opløse gelatine. Forlade røret på RT indtil brug. Aflive en voksen mus af cervikal dislokation. Placer musen fra trin 2.1.6 på en metallisk bakke og gøre en lille snit på huden gennem ensiform brusk ved hjælp af kirurgiske værktøjer. Udvid snit med begge hænder til at udsætte de bryst- og abdominal regioner. Åbne bughinden at eksponere mellemgulvet, og derefter åbne membran på begge sider. Skære den thorax bur langs de forreste aksillær linjer på begge sider, derefter fjerne thorax væggen ved at skære i en tværgående retning på placeringen af thymus at eksponere hjertet. Gør et lille snit på øret i højre atrium dræne blodet og indsætte en 22-gauge vingede nål i apex af venstre ventrikel. Tryk stemplet og perfuse væv med 10% “buffered” neutral formalin løsning. Efter udsætter organer i bækkenet, afbrød udgangen af rektum fra anus, og Adskil tarmene fra kroppen ved at skære mesenterium. For at isolere jejunum, skære tarmene på 4 cm fra anal side af mavens antrum. Kassér den anal halvdelen af de resterende tyndtarmen. Klip jejunum i halvdelen til at lette proceduren for rødmen. Belastning 20 mL 10% buffered neutral formalin løsning i 20-mL sprøjte, og vedhæfte den 18-gauge lige nål forberedt i trin 1.7 til stikkontakten. Injicér 10% “buffered” neutral formalin løsning fra den ene ende af den klippede jejunum skylle tarmindhold og løse tarm lumen overflade (figur 1A2). Vaske tarmen lumen ved at indsprøjte PBS som beskrevet i trin 2.1.15. Skyl flydende gelatine til tarm lumen som beskrevet i trin 2.1.15 at erstatte PBS med flydende gelatine. Tæt ene ende af den klippede jejunum af sutur ligatur ved hjælp af en 6-0 nylon skære sutur, fylde jejunum med flydende gelatine, og luk den modsatte ende af sutur ligatur (figur 1A3). Tilføje fire sutur knob til at passe en pølse-formet jejunum sektion til deprimerede-delen af en cryomold (figur 1A4).Bemærk: For cryomolds med en 20 mm x 25 mm x 5 mm deprimeret sektion, en ~ 20 mm pølse-lignende jejunum sektion er at foretrække. Blød væv i 50 mL af 15% saccharose i 10% “buffered” neutral formalin løsning natten over ved 4 ° C.Bemærk: Disse trin sikre cryoprotection af saccharose og protein fiksering af formalin gelatine og væv. Formalin-forklistres gelatine smelter ikke på RT, hvorimod ikke-fast forklistres gelatine ved 4 ° C smelter ved RT. 3. Fastgør indefrysning af gelatine-fyldt Jejunum væv Ved at skære jejunum på sutur knob, fremstilles tre pølse-lignende jejunum stykker med begge ender forbundet (figur 1A4). Juster pølse-lignende stykker i en cryomold for tilsætning af indlejring sammensatte i præparation af frossen væv prøver. Snap fryse cryomold i isopentane afkøles med flydende kvælstof. Butik cryomolds ved-80 ° CBemærk: Protokollen kan pause her. 4. immunfluorescens af Tuft celler ved hjælp af frit svævende snit frosset organmateriale Cryosectioning Angive både kryostaten kammertemperaturen (CT) og objektet temperatur (OT) til-22 ° C. Sted den frosne væv blokere i en cryomold i kryostatkammeret i mindst 15 min. Tilføj 3 mL PBS til en 35-mm kultur fad. Fjern frosne væv blok fra cryomold og skære blokken i halvdelen med et barberblad til at udsætte den tværgående del af jejunum. Montere en halv blok på en chuck (en kryostaten adapter) til afsnittet beskæringsplanet med barberblad. Afsnit gelatine-fyldt jejunum i 30 µm tykt sektioner. Brug frosne pincet til forsigtigt at overføre sektionerne til 35-mm kultur parabol forberedt i trin 4.1.2 (figur 2Bhøjre). Anvendelse af primære antistoffer Vaske de frit svævende sektioner i 35-mm kultur parabol 3 gange for 5 min med 3 mL PBS-T med mild ryster på en gensidig shaker (ca 36 gange / min). Forberede antigen hentning løsning: 0,3 mL antigen hentning løsning koncentrat (Table of Materials) i 2,7 mL i ultrarent vand. Tilsættes 3 mL antigen hentning til 35-mm kultur fadet indeholdende frit svævende sektioner. Slutning låg og forsegle kløften mellem skålen og låget med en stribe af vinyl bånd inkuberes ved 50 ° C i en hybridisering inkubator for 3 h uden rystelser. Fjern skålen fra inkubator og cool på RT for 20 min. Efter at fjerne vinyl bånd, vaske i afsnit 3 gange for 5 min hver med 3 mL PBS-T og mild ryster. Opsug PBS-T og tilsættes 5 dråber af blokerende løsning (Table of Materials) ind på sektionerne. Der inkuberes ved RT i 5 min. med mild ryster. Forberede den primære antistof løsning: 495 µL af 5% BSA i PBS med 5 µL af phospho-Y1798 girdin (pY1798) antistoffer (Tabel af materialer). Tilsættes 500 µL af primære antistof løsning på afsnittene (den blokerende løsning ikke behøver at blive fjernet). Placer fadet i en fugtig inkubation kammer og der inkuberes natten over ved 4 ° C med mild ryster.Bemærk: I natten inkubation kan udvides til op til tre nætter. Anvendelsen af sekundære antistoffer Vaske i afsnit 3 gange for 5 min hver i 3 mL PBS-t med mild ryster. Forberede fortyndet DAPI stamopløsning: 2 µL af DAPI stamopløsning (trin 1,5), 998 µL af PBS. Gøre sekundær antistof løsning: 476 µL af 5% BSA i PBS, 10.5 µL fortyndede DAPI løsning, 12,5 µL af phalloidin-fluorescerende farvestof konjugat stamopløsning, 1 µL af ged anti-kanin IgG-fluorescerende farvestof konjugat (bølgelængde: excitation 496 nm, emission 520 nm). Efter sugning PBS-T, anvende sekundær antistof løsning, og Inkuber i et lys-skærmet inkubation kammer på RT for 30 min med mild ryster. Vaske i afsnit 3 gange for 5 min hver med 3 mL PBS-T og mild ryster. Efter den sidste vask, fjerne PBS-T og erstatte med 3 mL PBS mangler polyoxyethylene(10) octylphenyl ether. Overføre skålen til en stereoskopisk mikroskop. Sted 200 µL af PBS i et slipværktøj på midten af en MAS-belagt hvidt glas dias og overføre én jejunum afsnit fra fadet i slipværktøjet ved hjælp af en P200 afpipetteres tip. Efter justering af afsnit justering under stereoskopiske mikroskop, Aspirér alle resterende PBS omkring afsnittet. Tilføj 20 µL af vandige montering medier og placere en 20 x 20 mm coverslip på toppen af medierne. Straks forsegle coverslip kanter med xylol-baserede montering medier. Placer diasset på en træ webtjenestekomponenter og lad xylol-baserede montering medierne til at størkne på RT for 2-3 h.Bemærk: Protokollen kan pause her. Efter xylol-baserede montering media størkner, kan dias opbevares i 2-3 uger i en lys-skærmet dias boks på RT. 5. konfokalmikroskopi Sætte immersionsolie på 63 X målsætningen om en Konfokal mikroskop. Vend coverslip-slide og læg diasset på scenen. Digitalisere TC billeder erhvervet ved laser bølgelængder 405, 488 og 555 nm, og opspare billeder i tiff format (.tiff).Bemærk: Vælg en påvisning filtersæt, der er relevante for fluorescens farvestoffer (dvs. excitation/emission maxima: 358/461 nm, 490/525 og 590/617).

Representative Results

Gelatine-fyldning af jejunum En typisk procedure for påfyldning mus jejunum med gelatine er vist (figur 1A), som er fordelene ved gelatine-påfyldning (figur 1B). Kort sagt, var den skrå spids af en 18-gauge lige nål fjernet for at beskytte mod piercing gut væg (figur 1A1). Gelatine fyldet blev opnået ved hjælp af 10% “buffered” neutral formalin løsning injiceres fra den ene ende af en klippede jejunum sektion til at skylle tarmen og at løse tarm lumen overflade (figur 1A2) før påfyldning med flydende gelatine ( ) Figur 1A3). De resulterende pølse-lignende stykker (figur 1A4) var indlejret, frosset og paa tvaers sectioned i 30 µm-tykke skiver i en kryostaten. I mangel af gelatine påfyldning, jejunal sektioner har tendens til at knækket, så villi svinge baglæns (figur 1Bvenstre). Gelatine påfyldning bevarer den runde disc-form af sektionerne og vedligeholder oprejst positionering af villi (figur 1Bhøjre). Billederne viser tydeligt fordelen ydes af gelatine udfylde bevare morfologi af frit svævende jejunum sektioner. Vellykket billeddannelse af intestinal tuft celler pY1798 antistoffer kan anvendes til variabel immunfarvning teknikker, herunder dot blotting, western blotting, paraffin afsnit farvning, tø monterede cryosection farvning eller frit svævende cryosection farvning1,9. I denne protokol fokuserede vi på frit svævende snit frosset organmateriale for fluorescens farvning af TCs i mus jejunum ved hjælp af pY1798 antistoffer, phalloidin og DAPI farvning for at påvise de strukturelle karakteristika af FKS1. I almindelighed, er TCs spredt med en hastighed på cirka én TC/100 epitelceller fra villus tip til krypten1. Repræsentative resultater viser, at pY1798 reproducerbar skildrer hele TCs, herunder membran, cytoplasma af den spool-formet soma, og de stærkt farvede lumenal spids, hvor robust signal kondens svarer til den fremspringende TOT en TC1 ()Figur 2A-2B). I mellemtiden, phalloidin er en phallotoxin, en familie af giftige bicykliske heptapeptides fra mushroom Amanita phalloides, og har høj affinitet for trådformede actin (F-actin), som er til stede i microvilli, der danner grænsen intestinal børste 11. Phalloidin reproducerbar og tydeligt markerer grænsen fortykket børste, der svarer til en masse af finrødder strækker sig fra tuft1. Således, den konsekvente Co lokalisering af pY1798 signaler (spool-formet soma, signal kondens på den lumenal spids) med den fremtrædende fortykket phalloidin-positive pensel grænse viser, at denne protokol med held identificerer TCs uanset om de er placeret på en villus ()figur 2A) eller i en krypt ()figur 2B). Lav-temperatur antigen hentning er effektiv til farvning frit svævende sektioner Varme-baserede antigen hentning på 95-99 ° C er almindeligt brugt til analyse af paraffinsnit og slide-monteret snit frosset organmateriale. Dog er anvende denne fremgangsmåde til frit svævende sektioner uden at forårsage skade vanskeligt, fordi disse sektioner er generelt mere skrøbelige end slide-monteret sektioner, der understøttes af dias12. Siden lav temperatur antigen hentning (50 ° C til 3 h) ved hjælp af et vandbad ikke påvirker morfologi af sektionerne frit svævende jejunum i indledende forsøg vi vurderet objektivt effektiviteten af antigen hentning i en blind test, som statistisk bekræftet effektiviteten af lav temperatur antigen hentning ()figur 3). Figur 1: Gelatine påfyldning af jejunum sektioner for morfologiske bevarelse af snit frosset organmateriale(A) fotografier af procedurer for intraluminal påfyldning af musen jejunum med gelatine. (A1) Den skrå spids af en 18-gauge lige nål er blevet fjernet for at undgå piercing gut væg. (A2) Bufferet neutral formalin opløsning (10%) blev injiceret i den ene ende af den klippede jejunum at skylle tarmindhold og løse tarm lumen overflade. (A3) Klippede jejunum fyldt med flydende gelatine og begge ender forbundet ved hjælp af en 6-0 nylon sutur (sorte pile). (A4) Fire flere sutur knob (hvide pile) placeret mellem de allerede eksisterende sutur knob (sorte pile) givet tre kortere stykker. Vævet vil derefter opdeles i tre pølse-lignende stykker på to angivne positioner (hvid pilespidser). (B) gavnlige virkninger af gelatine-påfyldning på frit svævende cryosection morfologi. Uden gelatine påfyldning, sektioner har tendens til at knækkes, tillader villi nemt svinge tilbage (venstre); med gelatine fyldning, en 30 µm tykt afsnit fastholder en disk form og af villi oprejst stilling er bevaret (til højre). Billeder blev fotograferet ved hjælp af Nomarski differential interferens kontrast. Skalere barer, 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: Repræsentative fluorescens billeder af musen intestinal tuft cellerKonfokal fluorescens billeder af FKS en villus (A) eller i en krypt (B), i frit svævende musen jejunum sektioner farves med lokationsspecifikke og fosforylering-status-specifikke antistoffer mod girdin fosforyleret på tyrosin 1798 ( pY1798, grøn, optimal excitation/emission bølgelængder 490/525 nm), phalloidin (rød, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå, 358/461 nm). Området afgrænses af hvide kasser i lav forstørrelse billeder (skala barer, 50 µm) er udvidet til højre (skala barer, 10 µm). pY1798 antistoffer pletten reproducerbar TCs, uanset placering (på en villus (A), eller i en krypt (B)), med farvning stede ved lumenal tip (pile), membran og cytoplasma af spool-formet TC soma. En fremtrædende fortykket pensel grænse i phalloidin farvning (pilespidser) er et andet karakteristisk tegn på FKS. venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: Lav temperatur antigen hentning forbedrer pY1798 immunfluorescensTo grupper af eksperimentelle procedurer blev sammenlignet for at bekræfte effektiviteten af lav temperatur antigen hentning. Frit svævende jejunum sektioner (30 µm tykt, n = 13) fra en enkelt frosne blok blev opdelt i to grupper, og dele fra hver gruppe var farves efter den komplette protokol eller den samme protokol mangler lav temperatur antigen hentning (trin 4.2.2). Efter farvning, afsnit blev monteret på individuelle dias mærket med gruppe numre og mærkning på hvert dias var dækket med malertape. Alle dias var blandet, mærket med nye numre på båndet og observeret under Fluorescens mikroskopi gennem et FITC-filteret. Total tæller af synlige pY1798-positive FKS blev i gennemsnit i hver gruppe, og blev vist i et søjlediagram (gennemsnit ± standardafvigelse). En to-sidede t-test blev udført for at sammenligne de gennemsnitlige tæller mellem de to grupper. P-værdier under 0,05 blev anset for statistisk signifikant. Lav-temperatur antigen hentning væsentligt forbedret effektiviteten af pY1798-immunfluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol blev designet til at give forskere uden histologi erfaring at opnå pålidelige billeder af tuft celler (TCs). Denne protokol har tre kritiske punkter: 1) brug af site- og fosforylering status-specifikke kanin polyklonale antistoffer mod menneskelige girdin fosforyleret på tyrosin 1798 (pY1798 antistoffer) der blev indhentet fra en bestemt virksomhed ( Immuno-Biological laboratorier = selskab X); 2) gelatine påfyldning af jejunum; og 3) lav temperatur antigen hentning. I bredeste forstand fosforylering status-specifikke antistoffer kan kategoriseres som modifikation-specifikke antistoffer, der kan genkende en bestemt type af posttranslationel modifikation (f.eks. acetylation, methylering eller fosforylering) af en protein på en bestemt aminosyre rester. Omori et al. og virksomhed X i fællesskab dannet pY1798 antistoffer af immuniserende kaniner med fosforyleres peptid, og rense de resulterende antistoffer ved hjælp af solid-fase væskekromatografi med et unphosphorylated peptid efter GOTOs metode^{9, 10}. pY1798 antistoffer var intensivt valideret in vitro- fosforylering assays ved hjælp af fuld længde menneskelige girdin udtryk vektorer med/uden et punkt mutation på tyrosin 1798⁹. Efterfølgende fandt Kuga et al. , at pY1798 antistoffer fra virksomhed X er en specifik og følsom markør for intestinal FKS¹. Inddragelse af pY1798 antistoffer fra firma X er således et afgørende punkt i denne protokol.

Gelatine indeholder kollagen udvundet fra dyrevæv og har længe været anvendt til at integrere væv prøver for histokemiske undersøgelser ved hjælp af snit frosset organmateriale¹³. Lav smeltepunkt gelatine, som er forklistres ved 4 ° C, men smelter ved stuetemperatur, begyndte at blive anvendt for at undgå negative virkninger af varme nødvendig for at opretholde gelatine i en flydende tilstand under indlejring¹⁴. I denne protokol, blev lavt smeltepunkt gelatine fremstillet af gelatine pulver, der gelatinizes ved 4 ° C og smelter ved RT brugt til at bevare morfologi af tværgående snit af musen jejunum frosset organmateriale. Når denne gelatine blev anvendt helt udfylde jejunum, blev prøver derefter formalin-fast at opnå irreversibel forklistring. Varme-induceret antigen hentning er en effektiv metode til at afsløre antigener, der er maskeret af aldehyd-holdige fikseringsmidler¹². Men de høje temperaturer (95-99 ° C i 30 min) almindeligt anvendt til analyse af paraffinsnit kan skade morfologi af væv/gelatine komplekse. Her brugte vi lav-temperatur antigen hentning (50 ° C til 3 h), der tillader både antigen hentning og bevarelse af væv morfologi.

pY1798 antistoffer kan mærke FKS, ikke kun i mus jejunum, men også i flere organer (mave, ileum, kolon og galdeblæren) fra mus og mennesker¹. Men fordi pY1798 signaler i ikke optagne væv fra alle væv vil hurtigt nedbrydes, denne protokol omfatter formalin injektion i jejunum lumen (trin 2.1.15., figur 1A2).

Der er begrænsninger i forbindelse med tykkelsen af frit svævende snit frosset organmateriale. Selv om tynde snit af frosset organmateriale kan være en fordel i form af gennemskinnelighed til mikroskopi, gør thinness disse sektioner fysisk sårbare. I modsætning hertil tykke snit frosset organmateriale er fysisk robust, men har lavere antistof permeabilitet i afsnittet. I denne protokol, 30 µm tykt afsnit blev brugt, var både fysisk stabilt og gennemtrængelig for antistoffer. Selv om denne metode var designet for forskere uden omfattende erfaring i histologi, hvis protokollen bør ikke, afsnit pY1798/villin/DAPI tredobbelt farvning af paraffin ligner der plejede med Kuga et al. kunne være udført¹. Paraffinsnit blev ikke brugt her at undgå problemerne i forbindelse med phalloidin farvning af F-actin i paraffinsnit.

På grund af bevarelsen af aminosyresekvenser støder op til girdin tyrosin-1798, kan pY1798 antistoffer anvendes til at plette TCs i andre arter end mus, herunder rotte og menneskelige. Gelatine fyldet bruges i denne protokol kan også anvendes for andre hule organer. Faktisk, pY1798 eller TC, kombinationen af gelatine påfyldning med lav temperatur antigen hentning kan være nyttige for at afsløre notorisk “vanskelige” epitoper i mus gut, og som følge heraf kan være af interesse for mange forskere.

Af girdin biologiske rolle og betydningen af dens fosforylering i FKS er uklart. Men en undersøgelse af Lin et al. foreslog at tyrosin fosforylering af girdin er knyttet til graden af F-actin polymerisering⁸. I mellemtiden, Kuga et al. fandt det dødelige doser af apoptose induktorer (fx., cisplatin, X-ray stråling) forårsaget en stor stigning i den relative hyppighed af TCs i tyndtarmen mus, som de hypotese kan være forbundet med den eventuel omregning fra enterocytes til FKS, i synkronisering med fosforylering af girdin i microvilli¹. Denne mulighed vil kræve yderligere undersøgelse i fremtiden. Tre grupper for nylig observeret hurtige stigning i TC frekvens efter parasit infektion^15,16,17. Således, denne frit svævende farvning kan bruges ikke kun til at analysere endoskopisk indsamlet menneskelige gut væv, men TC ophobning kan også støtte i diagnosticering af parasit infektion i human tarmen.

Materials

Slc:DDY 6-week-old female mice	Chubu Kagaku Shizai	Not applicable
Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)	Wako	196-02835
Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O	Wako	199-02825
Sodium chloride (NaCl)	Wako	199-10665
Triton X-100,  Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether	Katayama Chemical	Not applicable
Sucrose	Wako	190-00013
10% buffered neutral formalin solution	Muto Chemical	20215	Step 1.3.
Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12381
Methanol	Nacalai Tesque	21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	ThermoFisher Scientific	D1306
N.N-dimethylformamide (DMF)	Nacalai Tesque	13015-75
Bovine serum albumin	Sigma	A9647-10G
18-gauge stainless steel straight needle	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun	Kono Seisakusho	Not applicable
22-gauge winged needle	Terumo	SV-22DLK
20 mL TERUMO syringe	Terumo	SS-20ES
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
15 mL Iwaki centrifuge tubes	Iwaki	2325-015
1.5 mL micro test tube	Star	RSV-MTT1.5
Gelatin powder, Gelare-blanc	Nitta Biolab	2809
Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece	Sakura FineTech	4583
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)	Shoei Work's	1101-3
Isopentane	Nacalai Tesque	26404-75
Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x	Dako	S2367	Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.
Protein Block	Dako	X0909	Blocking solution in 4.2.5.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies	Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X	28143	Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11034
Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1	Matsunami Glass	C022221
Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy	Merck Millipore	107961
MAS-coated slide glass white	Matsunami Glass	MI-MAS-01
Wooden Mappe KO-type	Shoei Work's	99-40007
Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml	Zeiss	444960
Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
Ultrapure water production system	Advantec	GS-590
Plastic glove, Star Nitrile Glove	Star	RSU-NGVM
Cryostat	Leica Microsystems	CM1950
Deep freezer, SANYO Ultra Low	Sanyo	MDF-382
Showcase refrigerator	Nihon Freezer	NC-ME50EC
Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)	Taitec	0068750-000
Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)	Taitec	HB-100
Incubation chamber for immunostaining	Cosmo Bio	10DO
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)	Taitec	NR-1
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)	Tokyo Rika Kikai	MMS-3010
Stereoscopic microscope (for tissue handling)	Olympus	SZ61
Stereoscopic microscope (for Figure 1B)	Leica Microsystems	M165FC
Fluorescence microscope (for Figure 3)	Nikon	E800
Confocal laser-scanning microscope	Zeiss	LSM700