Mondeo et al. oppdaget at fosforylering status spesifikke antistoffer mot utgangen bindende protein girdin fosforylert på tyrosin 1798 (pY1798) kan brukes til å merke dusk celler (TCs). Denne protokollen lar robust visualisering av TCs bruke immunofluorescent farging av frittflytende jejunum cryosections med pY1798 antistoffer.
Utgangen bindende protein girdin er en cytosolic proteiner som kreves for utgangen remodeling utløse celle migrasjon i ulike vev. Girdin er fosforylert både reseptor og ikke-reseptor tyrosin kinaser på tyrosin 1798. Omori et al. utviklet området- og fosforylering status-spesifikke antistoffer mot menneskelig girdin på tyrosin-1798 (pY1798), som spesifikt binder fosforylert tyrosin-1798, men ikke unphosphorylated tyrosin-1798. pY1798 antistoffer er brukt spesielt merke dusk celler (TCs) som finnes i pattedyr mage vev, men funksjonen til disse cellene er uklart. Denne protokollen gir robust visualisering av TCs i jejunum med pY1798 antistoffer og immunofluorescence. For å sikre vellykket og enkel TC visualisering, denne protokollen inneholder to histologiske teknikker: produksjon av frittflytende cryosections fra gelatin fylt jejunum vev og lav temperatur antigen henting ved 50 ° C i 3 h. fylle jejunum med gelatin opprettholder form av frittflytende deler gjennom flekker prosedyren, mens lav temperatur antigen henting sikrer robust signaler fra TCs. vellykket bruk av denne protokollen gir pY1798 farging av TCs distribuert fra villus tips krypten. Farget TCs har en spool-formet soma og fluorescerende signaler kondensere på lumenal spissen som tilsvarer den utstikkende “dusk.” Phalloidin flekk colocalized med pY1798-positive TCs på fortykket Lyngen grensen, og tilsvarer en rootlet masse fra TC tuft. Denne protokollen kan brukes til å undersøke TCs i menneskelig biopsi prøver samlet med gastrointestinal endoskop. Videre rapportert TCs nylig å akkumulere følgende parasitt smitte i mus, tyder på at denne protokollen kan ha programmer for diagnostisering av parasitten infeksjoner i den menneskelige tarmen.
Dusk celler (TCs) er mindre spredt gastrointestinal epithelia som kjennetegnes av apikale dusker og spool-formet somas1. Selv om TCs ble først beskrevet i 19562TC funksjon er fortsatt uklart, delvis på grunn av mangel på pålitelige TC markører.
Enomoto et al. først preget begrepsordbok bindende protein girdin3, som er uttrykt i nervesystemet og ikke-nevrale vev som blodkar, hjertet ventiler, sener og skjelettlidelser muskel4. Mus med genetisk ablation over girdin vise vekst retardasjon og flere hjernen anomalier4,5,6. I mellomtiden er tap-av-funksjon mutasjon i menneskelig girdin forbundet med progressive encefalopati, alvorlig retardasjon og tidlig utbruddet epileptiske anfall7.
I 2011 identifisert Lin et al. dynamisk fosforylering av girdin på tyrosin 1798 formidlet av tyrosin kinaser som EGFR og Src8. De viste også at fosforylert girdin kreves for utgangen remodeling utløse celle migrasjon8. Omori et al. utviklet området – og fosforylering status-spesifikke antistoffer mot menneskelig girdin fosforylert på tyrosin 1798 (pY1798 antistoffer) etter GOTOs protokoll, og godkjent antistoffer bruker nettstedet-rettet mutagenese av uttrykket vektorer bærer full lengde girdin9,10. I 2017, Mondeo et al. rapportert at pY1798 etiketter TCs med høy spesifisitet og høy følsomhet1. PY1798 antistoffer ble vist å være overlegen til forrige TC indikatorer basert på gode flekker egenskaper som avslørte figuren er hele cellen, inkludert karakteristiske “dusk” på den lumenal spissen, men biologiske rollen girdin og phospho-girdin i TC funksjonen forblitt uklart1.
Metoden beskrevet i denne studien innebærer immunofluorescence flekker, en histologiske teknikk for å markere et bestemt protein på vev med en primær antistoff mot et mål protein og en fluorescens-konjugerte sekundære antistoff mot primært antistoff. Formålet med denne metoden er å tillate forskere histologiske rydding hente høykvalitets TC bilder. Denne protokollen bruker frittflytende cryosections unngå behovet for lysbilde montert cryosections eller parafinen delen. Men frittflytende delene er skjøre fraværet av støtte fra et glass lysbilde og snittykkelsen kan minske antistoff permeabilitet. Denne protokollen inneholder to tilnærminger som overvinne disse problemene: 1) fylle hele jejunum lumen med gelatin å bevare morfologi av frittflytende deler gjennom flekker prosedyrene, og 2) bruk av lav temperatur antigen henting til intensivere pY1798 signaler.
Denne protokollen ble utformet slik at forskere uten histology erfaring å få pålitelige bilder av dusk celler (TCs). Denne protokollen har tre kritiske punkter: 1) bruk av nettstedet- og fosforylering status-spesifikke kanin polyklonale antistoffer mot menneskelig girdin fosforylert på tyrosin 1798 (pY1798 antistoffer) som ble Hentet fra en bestemt selskap ( Immuno-Biological Laboratories = selskapet X); 2) gelatin fylling av jejunum; og 3) lav temperatur antigen henting. I videste forstand, fosforylering status-spesifikke antistoffer kan kategoriseres som endring-spesifikke antistoffer som gjenkjenne en bestemt type post-translasjonell modifikasjon (f.eks acetylation, metylering eller fosforylering) av en protein på en bestemt aminosyre rester. Omori et al. og selskapet X fellesskap generert pY1798 antistoffer immunisere kanin med fosforylert peptid og rensende resulterende antistoffer solid-fase kromatografi med en unphosphorylated peptid etter GOTOs metode9, 10. pY1798 antistoffer var intenst godkjent med i vitro fosforylering analyser ved hjelp av full lengde menneskelige girdin uttrykk vektorer med/uten en punkt mutasjon tyrosin 17989. Deretter funnet Mondeo et al. at pY1798 antistoffer fra selskapet X er en bestemt og følsom markør intestinal TCs1. Således, inkludering av pY1798 antistoffer fra selskapet X er et kritisk punkt i denne protokollen.
Gelatin inneholder kollagen Hentet fra dyr vev og har lenge vært brukt bygge inn vevsprøver for histochemical studier med cryosections13. Lav-smelte-punktet gelatin, som er gelatinized på 4 ° C, men smelter ved romtemperatur, begynte brukes for å unngå bivirkninger av varme nødvendig for å opprettholde gelatinen i flytende form under innebygging14. I denne protokollen, ble lav-smelte-punktet gelatin laget av gelatin pulver som gelatinizes på 4 ° C og smelter på RT brukt til å bevare morfologi av tverrgående cryosections av musen jejunum. Når denne gelatin ble brukt til å fylle jejunum, var prøvene så formalin-fast å oppnå irreversibel gelatinization. Varme-indusert antigen henting er en effektiv metode for å avsløre antigener som blir maskert av aldehyd inneholder fiksativene12. Men kan de høye temperaturene (95-99 ° C i 30 min) brukte for analyse av parafinsnitt skade morfologi av vev/gelatin komplekse. Her brukte vi lav temperatur antigen henting (50 ° C 3 h) som gjør at både antigen henting og bevaring av vev morfologi.
pY1798 antistoffer kan merke TCs ikke bare i musen jejunum, men også i flere organer (magen, ileum, kolon og galleblæren) fra mus og mennesker1. Men fordi pY1798 signaler i unfixed vev fra alle typer vev vil raskt forringe, denne protokollen inkluderer formalin injeksjon i jejunum lumen (trinn 2.1.15., figur 1A2).
Det er begrensninger knyttet til tykkelsen på frittflytende cryosections. Selv om tynne cryosections kan være gunstig i form av gjennomskinnelighet for mikroskopi, gjør thinness inndelingene fysisk sårbare. I kontrast, tykk cryosections er fysisk solid, men har lavere antistoff permeabilitet i delen. I denne protokollen, 30 µm tykke delene ble brukt som var både fysisk stabil og permeable til antistoffer. Selv om denne metoden ble utviklet for forskere uten erfaring i histology, hvis protokollen skal mislykkes, inndelinger pY1798/villin/DAPI trippel farging av parafin som brukes av Mondeo et al. kunne utføres1. Parafinsnitt ble ikke brukt her å unngå vanskelighetene knyttet phalloidin farging av F-utgangen i parafinsnitt.
På grunn av bevaring av amino acid sekvenser ved girdin tyrosin-1798, kan pY1798 antistoffer brukes til stain TCs i arter enn mus, inkludert rotte og menneske. Gelatin fylling i denne protokollen kan også brukes for andre hul organer. Faktisk, bortsett fra pY1798 eller TC kombinasjonen av fylle med lav temperatur antigen henting kan være nyttig for å avsløre notorisk “vanskelige” epitopes i musen-tarmen, og som en konsekvens, kan være av interesse for mange forskere.
Biologiske rollen girdin og betydningen av sin fosforylering i TCs er uklart. Men en studie av Lin et al. foreslo at tyrosin fosforylering av girdin er forbundet med graden av F-utgangen polymerisasjon8. I mellomtiden Mondeo et al. funnet at dødelige doser av apoptose indusere (f.eks., cisplatin, røntgen stråling) forårsaket en stor økning i den relative hyppigheten av TCs i tynntarmen mus som de hypotetiske kan være assosiert med den mulig konvertering fra enterocytes til TCs, i synkronisering med fosforylering av girdin i microvilli1. Denne muligheten vil kreve ytterligere undersøkelse i fremtiden. Tre grupper nylig observert rask økning i TC frekvens etter parasitt smitte15,16,17. Derfor denne frittflytende flekker kan brukes ikke bare til å analysere vanndampsteri samlet menneskelige tarmen vev, men TC opphopning kan også hjelpe i diagnosen parasitt smitte i den menneskelige tarmen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Naoya Asai ved Nagoya University for å gi nyttig forslag for utviklingen av lav temperatur antigen henting for frittflytende jejunum deler. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) i 2012 (JP25460493) og (B) i 2017 (JP17H04065) fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER), gir A-trinn i 2014 (AS251Z02522Q) og i 2015 (AS262Z00715Q) fra den Japan vitenskap og teknologi Agency (JSO) og en Takeda visjonær forskning Grant 2014 fra Takeda Science Foundation (til ma).
Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
Sucrose | Wako | 190-00013 | |
10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |