Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Summary

Kuga vd fosforilasyon-durum belirli antikor aktin bağlayıcı protein tirozin 1798 (pY1798) fosforile girdin karşı tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılabilir keşfetti. Bu iletişim kuralı serbest yüzer değişir cryosections pY1798 antikorlar ile immünfloresan boyama kullanarak TCs güçlü görselleştirme sağlar.

Abstract

Aktin bağlayıcı protein girdin aktin çeşitli dokularda hücre göç tetiklemek için remodeling için gerekli olan sitozolik bir proteindir. Reseptör ve reseptör tirozin kinaz tirozin 1798, fosforile girdin. Omori vd dağıtılan ve özellikle fosforile tirozin-1798, ancak unphosphorylated tirozin-1798 bağlayan insan (pY1798), tirozin-1798 girdin karşı site – ve fosforilasyon durum özel antikorlar geliştirdi. pY1798 antikorlar özellikle memeli gastrointestinal dokularda bulunan tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılan, ancak bu hücreler belirsiz işlevidir. Bu iletişim kuralı TCs güçlü görselleştirme pY1798 antikorlar ve ayirt kullanarak Jejunumdaki sağlar. Başarılı ve basit TC görselleştirme emin olmak için bu iletişim kuralı iki histolojik teknikler içerir: jelatin dolu değişir doku ve 50 ° C 3 h. ile değişir doldurma için düşük sıcaklık antijen alımı yüzen cryosections imalatı düşük sıcaklık antijen alma güçlü sinyaller gelen TCs. başarılı kullanımı, bu iletişim kuralı için villus ucundan dağıtılmış Kıbrıslı Türkler, pY1798 boyama sonuçları sağlar, ancak jelatin serbest yüzer bölümleri boyama prosedürü boyunca şeklini korur mezar odası. Lekeli TCs biriktirme şeklinde soma var ve floresan sinyalleri için çıkıntılı ‘tutam.’ karşılık gelen lumenal ucundaki yoğunlaşmak Phalloidin boyama pY1798 pozitif TCs kalınlaşmış fırça sınır ile colocalized ve TC tutam uzanan bir rootlet kitle karşılık gelir. Bu iletişim kuralı ile gastrointestinal endoskoplar toplanan insan biyopsi örneklerinde TCs incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, TCs son zamanlarda parazit enfeksiyonu farelerde, ardından birikir bu protokol insan gut tanı parazit enfeksiyonları için uygulamalar olabilir düşündüren bildirildi.

Introduction

Tutam hücreleri (TCs) apikal tufts ve biriktirme şeklinde somas¹ile karakterize gastrointestinal epiteli, küçük dağınık bileşenleridir. Kıbrıslı Türkler ilk olarak 1956²‘ de açıklanan rağmen TC işlevi, kısmen güvenilir TC işaretleri eksikliği nedeniyle belirsizdir.

Enomoto vd. ilk sinir sisteminin yanı sıra kan damarları, kalp kapakları, tendon ve kas iskelet⁴gibi sigara-nöro dokuları ifade³, girdin aktin bağlayıcı protein ile karakterizedir. Girdin, genetik ablasyon ile fareler büyüme geriliği ve birden çok beyin anomalileri^4,5,6görüntülenir. Bu arada, insan girdin içinde işlev kaybı mutasyon ilerleyici ensefalopati, ağır retardasyon ve erken başlangıçlı Epileptik nöbetler⁷ile ilişkilidir.

2011 yılında, Lin ve ark. , tirozin tirozin kinaz EGFR ve Src⁸gibi tarafından aracılı 1798 girdin, dinamik fosforilasyon tespit edilmiştir. Onlar da fosforile girdin hücre geçiş⁸tetiklemek için aktin tadilat nedeniyle gerekli olduğunu gösterdi. Omori vd. sitesi – geliştirilen ve insan girdin karşı fosforilasyon durum özel antikorlar Goto’nın protokol sonrası tirozin 1798 (pY1798 antikorlar) fosforile ve site yönettiği mutagenesis kullanarak antikorlar doğrulanmış ifade taşıma tam uzunlukta girdin^9,10Vektörler. 2017 yılında, Kuga vd. Bu pY1798 yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet¹ile Kıbrıslı Türkler etiketleri bildirdi. PY1798 antikorlar fosfo-TC girdin ve önceki TC işaretleri karakteristik lumenal ucunda ‘ tutam’ henüz dahil olmak üzere bütün hücre şekil girdin biyolojik rolü ortaya mükemmel boyama özelliklerine göre üstün olması gösterilmiştir işlev belirsiz¹kaldı.

Bu çalışmada açıklanan yöntem boyama, belirli bir protein bir hedef protein karşı birincil bir antikor ve birincil karşı floresan Birleşik ikincil antikor kullanarak doku üzerinde işaretlemek için bir histolojik teknik ayirt içerir antikor. Bu yöntemin amacı araştırmacılar sınırlı histolojik tecrübesi ile yüksek kaliteli TC görüntüler elde etmek izin vermektir. Bu protokol slayt monte cryosections ihtiyacını önlemek veya bölüm alkol serbest yüzer cryosections kullanır. Ancak, serbest dalgalı bölümleri bir cam slayt desteğinden yokluğu nedeniyle kırılgan ve bölüm kalınlığı antikor geçirgenliğini azaltmak olabilir. Bu iletişim kuralı bu sorunları aşmak iki yaklaşım içerir: 1) tüm değişir lumen serbest yüzer bölümleri boyunca boyama işlemleri, Morfoloji korumak için jelatin ile doldurma ve 2) düşük sıcaklık antijen alma için kullanımı pY1798 sinyalleri güçlendirin.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve gelişimsel araştırma, Aichi insan Servis Merkezi Enstitüsü kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (uygulama numarası: M-03). 1. hazırlıkları Fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 L hazırlamak: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, 4,5 g NaCl 80.0 g (RT) oda sıcaklığında 10 L. mağaza çözümün nihai bir birime ultrasaf su eklenir. PBS-T: 200 mL PBS adım 1.1 ile polyoxyethylene(10) octylphenyl eter 100 µL % 0.05 (vol:vol) son bir konsantrasyon için 200 mL hazırlayın. Mağazada RT. Eldiven ve göz koruması giyen, 50 mL % 15 Sükroz arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin çözümde hazırlamak: 7.5 g Sükroz % 10 eklendi, tarafsız formalin çözüm (Tablo reçetesi) 50 mL nihai bir birime arabelleğe alınmış. Mağazada RT.Dikkat: Arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin çözüm içinde formaldehit teneffüs ve/veya deri/göz kişiyle tehlikeli olabilir. Dikkatli bir şekilde başa. 1.5 mL 200 adet/mL phalloidin-floresan boya eşlenik stok çözeltisi hazırlamak: phalloidin-floresan boya eşlenik (1 flakon, liyofilize katılar, uyarma ve emisyon dalga boylarında 300 kontur: 581 nm ve 609 nm, sırasıyla) 1,5 mL askıya metanol. Karanlıkta-20 ° C’de çözümde mağaza 5 mg / mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole hazırlamak, dihydrochloride (DAPI) stok çözüm: DAPI 10 mg 2 ml n, N-dimethylformamide (DMF). Karanlıkta-20 ° C’de çözümde mağaza %5 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde hazırlamak: 0.5 gram BSA, PBS 10 mL. 4 ° C’de mağaza Eğimli bir nipper kullanarak bir 18’lik düz iğne ucunu kaldırın ve sıvı iğne Lümen (şekil 1A1) akış izin vermek için bir boyuna yönde nipped sonuna bir pincher ile çimdik.Not: Protokol burada duraklatılmış. 2. hayvan diseksiyon ve yalıtım değişir Bir fare perfüzyon fiksasyonu Eldiven giymek ve iyi havalandırılan bir alanda iş. 100 mL cam kabı hazırlamak, % 10 arabelleğe tarafsız formalin çözüm, cerrahi araçlar (makas, pens), metalik bir tepsi, 6-0 naylon dikiş, 1.7 olduğu gibi hazırlanan bir 18’lik düz iğne kesmek bir 22’lik kanatlı iğne, 20 mL şırınga. 20 mL % 10 arabelleğe alınmış tarafsız formalin çözeltisi cam kabı 20 mL şırınga yük ve 22’lik kanatlı iğne prizine takın. Sıvı jelatin PBS (son % 5 jelatin) 20 ml 50 mL santrifüj tüpü içinde 1 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. RT 15 dakikadır iliklerine kadar bir su banyosu için 15 dk 50 ° C’de kuluçkaya sallayarak olmadan. Kısaca girdap ve başka bir 15 dakika jelatin tamamen erimesi 50 ° C’de kuluçkaya. Tüp kadar kullanmak RT bırakın. Yetişkin bir fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Adım 2.1.6 fareden metalik bir tepsiye yerleştirin ve cerrahi araçlarını kullanarak ensiform kıkırdak ile cilt üzerinde küçük bir kesi yapmak. Kesik göğüs ve karın bölgelerinde ortaya çıkarmak için her iki el ile genişletin. Diyafram ortaya çıkarmak için karın zarını açın ve sonra her iki tarafta diyaframı açın. Her iki tarafta anterior aksiler çizgisinde göğüs kafesi kesilmiş, sonra kalp ortaya çıkarmak için timus konumunda enine yönde keserek torasik duvarın kaldırın. Kanı ve bir 22’lik kanatlı iğne sol ventrikül apex eklemek için sağ atrium auricle üzerinde küçük bir kesi yapmak. % 10 kurcalayarak sıvı için itme pistonu tarafsız formalin çözüm arabelleğe alınmış. Pelvis organlarda ortaya sonra rektum anüs üzerinden sonu kesti ve bağırsak bıçaklanmasından kesim tarafından vücuttan ayrı. Değişir yalıtmak için bağırsak mide test anal tarafındaki 4 cm kesti. Kalan ince bağırsak anal yarısı atın. Değişir reçeteye göre sarf yordamı kolaylaştırmak için ikiye küçük. Yük % 10 20 mL tarafsız formalin çözüm 20 mL şırınga arabelleğe alınmış ve çıkış 1.7. adımda hazırlanan 18’lik düz iğne ekleyebilirsiniz. Arabelleğe alınan % 10 tarafsız formalin eriyik–dan bir son-in kirpik değişir bağırsak içeriğini floş için ve gut Lümen yüzey (şekil 1A2) düzeltmek için enjekte. Gut Lümen 2.1.15 adımda anlatıldığı gibi PBS enjekte edilerek yıkayın. PBS ile sıvı jelatin yerine 2.1.15 adımda açıklandığı gibi bağırsak Lümen içine sıvı jelatin floş. 6-0 naylon kullanarak dikiş ligasyonu tarafından kısaltıldı değişir yakın bir ucunu dikiş kesip, değişir sıvı jelatin ile doldurun ve ucunu dikiş ligasyonu (şekil 1A3) kapatın. Depresif bölümüne bir cryomold (şekil 1A4) bir sosis şeklinde değişir bölümü sığacak şekilde dört dikiş knot ekleyin.Not: bir 20 x 25 mm x 5 mm depresif bölümü ile cryomolds için bir ~ 20 mm sosis gibi değişir bölümü tercih edilir. 50 ml % 15 Sükroz gecede 4 ° C’de % 10 arabelleğe alınmış tarafsız formalin çözümde dokular emmekNot: Aşağıdaki adımları cryoprotection tarafından jelatin ve doku formalin sukroz ve protein fiksasyon tarafından emin olun. Oysa RT. sabit olmayan gelatinized jelatin 4 ° C’de erir formalin gelatinized jelatin RT eritmek değil 3. donma jelatin dolu değişir dokuların oturtun Dikiş saatte mil hızla değişir kesim tarafından üç sosis gibi değişir taşlarla bakmaksızın her iki ucu (şekil 1A4) elde edilir. Sosis gibi parçalar halinde dondurulmuş doku numunelerin hazırlanması için bileşik katıştırma ek bir cryomold hizalayın. Ek nitrojen ile soğutmalı isopentane cryomold dondur. Cryomolds-80 ° C’de depolayınNot: Protokol burada duraklatılmış. 4. tutam ayirt serbest yüzer Cryosections kullanarak hücreleri Cryosectioning Cryostat Oda sıcaklığı (CT) ve nesne sıcaklık (OT)-22 ° c için ayarla Yer donmuş doku engellemek için en az 15 dakika cryostat odasında bir cryomold içinde. PBS 3 mL 35-mm kültür yemek için ekleyin. Donmuş doku blok cryomold kaldır ve blok değişir enine bölümünü ortaya çıkarmak için bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm. Bir mount kesme düzleminin jilet ile bölüm için bir ayna (cryostat adaptör) blokta yarısı. Bölüm 30 µm kalınlığında bölümlere jelatin dolu değişir. Forseps yavaşça 4.1.2 (şekil 2Bdeğil) adımda hazırlanan 35-mm kültür çanak içine bölümleri aktarmak için dondurulmuş kullanın. Birincil antikorlar uygulanması 3 hafif sallayarak üzerinde karşılıklı bir shaker ile mL PBS-T ile her 5 min için 3 kez 35-mm kültür çanak serbest yüzer bölümlerde yıkayın (yaklaşık 36 kez / dk). Hazırlayın Antigen alma çözüm: 0.3 mL 2.7 ml ultrasaf su antijen alma çözüm konsantresi (Malzemeler tablo). Antijen alma çözüm 3 mL serbest yüzer bölüm içeren 35-mm kültür yemek için ekleyin. Kapağını kapatın, çanak ve kapak vinil bandın bir şerit ile arasındaki boşluğu mühür ve 50 ° c 3 h için hibridizasyon kuluçka kuluçkaya sallayarak olmadan. Çanak kuluçka ve serin RT, 20 dk kaldırın. Vinil teyp kaldırdıktan sonra 3 kez 5 min için her 3 mL ile PBS-T ve hafif sallayarak bölümleri yıkayın. PBS-T Aspire edin ve engelleme çözüm (Tablo reçetesi) bölümleri üzerine 5 damla ekleyin. RT hafif sallayarak ile 5 min için kuluçkaya. Birincil antikor çözüm hazırlamak: PBS %5 BSA 495 µL 5 µL fosfo-Y1798 (pY1798) girdin antikor (Malzemeler tablo) ile. Birincil antikor çözüm (engelleme çözüm kaldırılması gerekmez) bölümler üzerine 500 µL ekleyin. Bir oksijen kuluçka odasında çanak yerleştirin ve gecede 4 ° c hafif sallayarak ile kuluçkaya.Not: Gece kuluçka ilâ üç gece için genişletilebilir. İkincil antikorlar uygulanması 3 kere 5 min için her 3 ml hafif sallayarak ile PBS-t bölümleri yıkayın. Seyreltilmiş DAPI hisse senedi çözüm hazırlamak: 2 µL DAPI hisse senedi çözüm (Adım 1.5), PBS 998 µL. İkincil antikor çözüm olun: 476 µL PBS, seyreltilmiş DAPI çözüm, phalloidin-floresan boya eşlenik hisse senedi çözüm 12.5 µL, keçi Anti-tavşan IgG-floresan boya eşlenik 1 µL 10.5 µL % 5 BSA (dalga boyu: uyarma 496 nm, emisyon 520 nm). PBS-T aspirating sonra ikincil antikor çözümü uygulamak ve hafif sallayarak ile 30 dk için RT, bir ışık korumalı kuluçka odasında kuluçkaya. 3 kere 5 min için her 3 mL ile PBS-T ve hafif sallayarak bölümleri yıkayın. Son yıkama sonra PBS-T kaldırın ve polyoxyethylene(10) octylphenyl eter eksik PBS 3 mL ile değiştirin. Yemek için stereoskopik mikroskop aktarın. Bir damlacık bir MAS kaplı beyaz cam slayt ve transfer bir değişir bölümünden P200 damlalıklı ucu kullanarak damlacık amacına ortasına içinde yer 200 µL PBS. Bölüm hizalama stereoskopik mikroskop altında ayarladıktan sonra bölümü çevreleyen tüm kalan PBS Aspire edin. 20 µL sulu montaj medya ekleyin ve 20 x 20 mm coverslip medya üstüne yerleştirin. Hemen coverslip kenarları montaj Ksilen tabanlı medya ile kapatın. Slayt üzerinde bir ahşap mappe yerleştirin ve RT 2-3 h için kuvvetlendirmek montaj Ksilen tabanlı medya sağlar.Not: Protokol burada duraklatılmış. Sonra montaj Ksilen tabanlı medya katılaşır, slaytları 2-3 hafta boyunca RT. adlı bir ışık korumalı slayt kutusunda saklanabilir 5. confocal mikroskobu Daldırma yağ confocal mikroskop 63 X amaçta koyun. Coverslip-slayt geri çevirmek ve slayt sahne alanı üzerine yerleştirin. Lazer dalga boyu 405, 488 ve 555 nm’de alınan TC görüntüleri dijital ortama ve görüntüleri TIFF biçimi (.tiff) kaydedin.Not: floresan boyalar için uygun olan bir algılama filtre seçin (yani, uyarma/emisyon maxima: 358/461 nm, 490/525 ve 590/617).

Representative Results

Jelatin-dolgu değişir Jelatin-(şekil 1B) dolum yararları olduğu gibi fare değişir jelatin ile doldurmak için tipik bir yordam (şekil 1A) gösterilir. Kısacası, eğimli bir 18’lik düz iğne ucu (şekil 1A1) bağırsak duvarı piercing karşı korumak için kaldırıldı. Jelatin dolgu elde kullanarak % 10 arabelleğe alınmış bir kirpik değişir bölümü bağırsak temizleme ve gut Lümen yüzey (şekil 1A2) düzeltmek için bir ucundan enjekte tarafsız formalin çözüm doldurma sıvı jelatin ( ) ile önce Şekil 1A3). Elde edilen sosis gibi parçalar (şekil 1A4) gömülü, dondurulmuş ve kemiği bir cryostat 30 µm kalınlığında dilimler halinde kesitli. Doldurma jelatin yokluğunda jejunal bölümleri geri sallanmaya villus izin kink için (şekil 1Bsol) eğilimindedir. Jelatin doldurma bölümleri yuvarlak disk şeklinde korur ve dik villus (şekil 1Bdeğil) konumlandırma korur. Görüntüleri serbest yüzer değişir bölümleri morfolojisi koruyarak doldurma jelatin tarafından tanınan yararı açıkça göstermektedir. Bağırsak tutam hücre başarılı görüntüleme pY1798 antikor dot Blot, western Blot, parafin bölüm boyama, boyama tezcan monte cryosection veya serbest yüzer cryosection1,9boyama gibi değişken immunostaining teknikleri için uygulanabilir. Bu protokol için floresan TCs pY1798 antikorlar, phalloidin ve TCs1yapısal özelliklerini göstermek için boyama DAPI kullanarak fare değişir içinde boyama için serbest yüzer cryosections üzerinde duruldu. Genel olarak, Kıbrıslı Türkler yaklaşık bir TC/100 epitel hücrelerinin villus ucundan mezar odası1′ e bir oranda dağılmış. O pY1798 tekrarlanarak zarı, sitoplazma biriktirme şeklinde soma ve güçlü sinyal yoğunlaşma bir TC1 tutam’ çıkıntılı kaynakçalara şiddetle lekeli lumenal ucu da dahil olmak üzere tüm TCs delineates temsilcisi sonuçları göster ()Şekil 2A-2B). Bu arada, phalloidin bir phallotoxin, zehirli bicyclic heptapeptides mantar Amanita phalloides, gelen bir ailenin ve bağırsak fırça sınır oluşturan microvilli mevcut olduğu için ipliksi aktin (F-aktin), yüksek ilgi vardır 11. Phalloidin tekrarlanarak ve belirgin işaretleri1tutam uzanan rootlets bir kitle için karşılık gelen kalınlaşmış fırça sınır. Böylece, bu iletişim kuralı başarıyla TCs bağımsız olarak tanımlayan pY1798 sinyalleri (soma, biriktirme şeklinde sinyal yoğunlaşma lumenal uç) belirgin kalınlaşmış phalloidin pozitif fırça sınır ile tutarlı co lokalizasyonu gösterir olup olmadığını bir i. (2A rakam) veya (2B rakam)bir crypt içinde bulunurlar. Düşük sıcaklık antijen alma serbest yüzer bölümleri boyama için etkilidir 95-99 ° c ısı tabanlı antijen alma parafin kesitler ve slayt monte cryosections analiz için yaygın olarak kullanılır. Tür bölümleri genellikle slayt12tarafından desteklenen slayt monte edilmiş bölümlerde daha kırılgan olduğundan Ancak, bu yaklaşım serbest yüzer bölümlerine zarar vermeden uygulamak zordur. Düşük sıcaklık antijen alma (50 ° C 3 h için) beri bir su banyosu kullanarak morfolojisi etkilemez mi ön deneyler serbest yüzer değişir kısımlarında antijen alma bir kör objektif etkinliğini değerlendirildi testi, hangi istatistiksel olarak düşük sıcaklık antijen alma ()şekil 3)etkinliğini doğruladı. Resim 1: Jelatin dolum cryosections morfolojik korunması için değişir bölümlerinYordamlar için fare değişir jelatin ile intraluminal dolgu (A) fotoğrafları. (A1) Eğimli bir 18’lik düz iğne ucu gut duvar piercing önlemek için kaldırıldı. (A2) Tamponlu tarafsız formalin çözüm (% 10) bağırsak içeriğini temizlemek ve gut Lümen yüzey düzeltmek için kırpılmış değişir bir ucunu enjekte ettiler. (A3) Kirpik değişir sıvı jelatin ve her iki tarafın 6-0 naylon dikiş (siyah oklar)kullanarak bakmaksızın dolu. (A4) Önceden varolan dikiş knot (siyah oklar) arasında yerleştirilmiş dört daha fazla dikiş knot (beyaz ok) üç kısa parça vermiştir. Doku sonra iki belirtilen konumda (beyaz ok uçları), üç sosis gibi parçalara ayrılacaktır. (B) yararlı etkileri jelatin doldurma serbest yüzer cryosection morfolojisi. Jelatin doldurma olmadan, bölümler fantazi, kolayca geri (sol)sallanmaya villus bırakmak eğilimindedir; jelatin dolgulu 30 µm kalınlığında bölümünde bir disk şekli tutar ve dik villus korunmuş (sağda)konumudur. Nomarski fark girişim Karşıtlık’ı kullanarak görüntüleri çekildi. Ölçek çubukları, 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2: Temsilcisi Floresans görüntüler fare bağırsak tutam hücreTCs villus (A) veya bir crypt içinde görüntülerini confocal Floresan (B), serbest dalgalı fare değişir bölümleri ile siteye özgü lekeli ve fosforilasyon durum özel antikorlar karşı girdin tirozin fosforile 1798) pY1798, yeşil, en uygun uyarma/emisyon dalga boyu 490/525 nm), phalloidin (kırmızı, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, mavi, 358/461 nm). (Ölçek çubukları, 50 µm) düşük büyütme görüntülerde beyaz kutuları tarafından çevrili alanı sağdaki (ölçek çubukları, 10 µm) genişletilir. pY1798 antikor TCs, mevcut lumenal ipucu (oklar), membran ve biriktirme şeklinde TC soma sitoplazma boyama ile (bir i. (A), veya (B)bir crypt içinde), konumdan bağımsız olarak tekrarlanarak leke. Phalloidin (ok uçları) Boyama içinde belirgin kalınlaşmış fırça sınır başka bir ayırt edici TCs. işaretidir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: Düşük sıcaklık antijen alma pY1798 ayirt artırır.Deneysel yordamları iki grup düşük sıcaklık antijen alma etkinliğinin onaylamak için karşılaştırıldı. Serbest dalgalanma değişir bölümler (30 µm kalınlığında, n = 13) üzerinden tek bir donmuş blok iki gruba ayrıldı ve her grup bölümlerden lekeli tam protokol sonrası veya aynı eksik olan düşük sıcaklık antijen alma (Adım 4.2.2) protokol. Boyama sonra bölümleri tek tek slaytlarda grup numaraları ile etiketli monte edildi ve her slaytta etiketleme maskeleme bandı ile kaplıydı. Tüm slaytları karıştırılır, banttaki yeni numaraları ile etiketli ve floresan mikroskobu altında bir FITC süzgeci gözlenen. Toplam sayıları görünür pY1798 pozitif TCs, her grupta ortalama ve bir çubuk grafik (ortalama ± standart sapma) sergilendi. İki kuyruklu t-test ortalama sayıları iki grup arasında karşılaştırmak için gerçekleştirildi. P-değerleri aşağıda 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Düşük sıcaklık antijen alma pY1798 ayirt verimliliğini önemli ölçüde geliştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu protokol araştırmacılar Histoloji deneyimi olmayan bir tutam hücre (TCs) güvenilir görüntüleri elde etmek izin vermek için tasarlanmıştır. Bu iletişim kuralının üç kritik noktaları vardır: 1) bir özel şirket (elde edildi insan 1798 (pY1798 antikorlar) tirozin fosforile girdin karşı site – ve fosforilasyon durum özel tavşan poliklonal antikorlar kullanımı Immuno-Biological laboratuvarları şirket X =); 2) jelatin dolgu değişir; ve 3) düşük sıcaklık antijen alma. En geniş anlamda, fosforilasyon durum özel antikorlar translasyonel modifikasyon (örneğin asetilasyon, metilasyon veya fosforilasyon) belirli bir tip tanımak değişiklik özgü antikor kategorize edilebilir bir protein, belirli amino asit tortu. Omori vd. ve şirket X pY1798 antikorlar fosforile peptid tavşanlarla immunizing ve katı faz Kromatografi Goto’nın yöntemi^9, takip unphosphorylated bir peptid ile kullanarak elde edilen antikor arındırıcı tarafından ortaklaşa oluşturulan ¹⁰. pY1798 antikorlar yoğun tam uzunlukta insan girdin ifade vektörel çizimler kullanarak/tirozin 1798⁹nokta mutasyon olmadan vitro fosforilasyon deneyleri ile doğrulanmış. Daha sonra Kuga vd. pY1798 antikorlar şirket X bağırsak Kıbrıslı Türkler¹özel ve hassas bir işaretleyici bulundu. Böylece, pY1798 antikorlar şirket X eklenmesi bu protokolündeki bir kritik noktasıdır.

Jelatin ve uzun histochemical araştırmalar cryosections¹³kullanarak doku örnekleri katıştır için kullanılan hayvan dokulardan çıkarılan kollajen içerir. Jelatin bir sıvı durumdaki¹⁴katıştırma sırasında korumak için gerekli ısı olumsuz etkileri önlemek için uygulanacak olan 4 ° C’de gelatinized ama oda sıcaklığında erir, düşük erime noktası jelatin başladı. Bu protokol için 4 ° C’de gelatinizes ve RT erir jelatin tozu imal düşük erime noktası jelatin fare değişir enine cryosections Morfoloji korumak için kullanıldı. Bu jelatin tamamen değişir doldurmak için kullanıldığında, örnekleri sonra formalin-geri dönüşümsüz gelatinization ulaşmak için tespit edildi. Isı kaynaklı antijen alma aldehid içeren Fiksajlar¹²tarafından maskeli antijenleri ortaya çıkarmak için etkili bir yöntemdir. Ancak, sık kullanılan parafin kesitler analizi için yüksek sıcaklık (30 dk için 95-99 ° C) doku/jelatin karmaşık morfolojisi zarar verebilir. Burada biz antijen alma ve doku Morfoloji korunması sağlar düşük sıcaklık antijen alma (50 ° C 3 h için) kullanılır.

pY1798 antikor TCs fare değişir değil sadece, aynı zamanda birden çok organlarda (mide, ileum, iki nokta üst üste ve safra kesesi) fareler ve insanlar¹etiketleyebilirsiniz. PY1798 sinyalleri herhangi bir dokusundan sabitlenmemiş dokularda hızla düşer çünkü ancak, bu iletişim kuralını değişir Lümen içine formalin enjeksiyon içerir (Adım 2.1.15., şekil 1A2).

Serbest dalgalanma cryosections kalınlığı ile ilgili sınırlamalar vardır. İnce cryosections kalınlığı mikroskopi için açısından avantajlı olmasına rağmen inceliği bu bölümleri fiziksel olarak savunmasız bırakıyor. Buna ek olarak, kalın cryosections fiziksel olarak sağlam, ama daha düşük antikor geçirgenliği bölüme sahip. Bu protokol için 30 µm kalınlığında bölümlerde kullanılan hem fiziksel olarak istikrarlı ve geçirgen antikorlar için vardı. İletişim kuralı başarısız olması durumunda bu yöntem Histoloji, geniş deneyim olmadan araştırmacılar için tasarlanmış olsa da, pY1798/villin/DAPI parafin üçlü boyama Kuga vd tarafından kullanılan benzer bölümler gerçekleştirilen¹olabilir. Parafin kesitler burada F-aktin parafin bölümlerde, phalloidin boyama ile ilişkili sorunları yaşamamak için kullanılan değildi.

Amino asit dizileri tirozin-1798 girdin için bitişik korunması nedeniyle, fare, sıçan ve insan da dahil olmak üzere başka türlerin TCs leke pY1798 antikorlar uygulanabilir. Bu protokol için kullanılan jelatin dolum için içi boş diğer organlara da uygulanabilir. Gerçekten de, dışında pY1798 veya TC, düşük sıcaklık antijen alma ile doldurma jelatin kombinasyonu Rootkitler fare gut “zor” epitopları ifşa için yararlı olabilir ve sonuç olarak, pek çok araştırmacı için ilgi olabilir.

Girdin biyolojik rolü ve TCs onun fosforilasyon önemi belirsizdir. Ancak, Lin ve ark. tarafından yapılan bir çalışma önerilen bu tirozin fosforilasyon girdin, büyük F-aktin polimerizasyon⁸derece ile ilişkilidir. Bu arada, Kuga vd buldum bu öldürücü apoptosis indükleyicileri doz (e.g., sisplatin, x-ışını radyasyon) TCs göreli sıklığı onlar olan fare bağırsağı içinde büyük bir artış nedeni ile iliskili olabilir olası dönüştürme enterositler Kıbrıslı Türkler, microvilli¹‘ girdin fosforilasyon ile senkronizasyon içinde. Bu olasılığı gelecekte ek bir araştırma gerektirir. Son zamanlarda hızlı gözlenen üç grup parazit enfeksiyonu^15,16,17takip TC frekans artırmak. Böylece, bu yüzen boyama sadece insan gut endoskopik toplanan dokuları analiz etmek için kullanılabilir, ama TC birikimi de insan bağırsak parazit enfeksiyon tanısında yardımcı olabilir.

Materials

Slc:DDY 6-week-old female mice	Chubu Kagaku Shizai	Not applicable
Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)	Wako	196-02835
Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O	Wako	199-02825
Sodium chloride (NaCl)	Wako	199-10665
Triton X-100,  Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether	Katayama Chemical	Not applicable
Sucrose	Wako	190-00013
10% buffered neutral formalin solution	Muto Chemical	20215	Step 1.3.
Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12381
Methanol	Nacalai Tesque	21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	ThermoFisher Scientific	D1306
N.N-dimethylformamide (DMF)	Nacalai Tesque	13015-75
Bovine serum albumin	Sigma	A9647-10G
18-gauge stainless steel straight needle	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun	Kono Seisakusho	Not applicable
22-gauge winged needle	Terumo	SV-22DLK
20 mL TERUMO syringe	Terumo	SS-20ES
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
15 mL Iwaki centrifuge tubes	Iwaki	2325-015
1.5 mL micro test tube	Star	RSV-MTT1.5
Gelatin powder, Gelare-blanc	Nitta Biolab	2809
Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece	Sakura FineTech	4583
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)	Shoei Work's	1101-3
Isopentane	Nacalai Tesque	26404-75
Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x	Dako	S2367	Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.
Protein Block	Dako	X0909	Blocking solution in 4.2.5.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies	Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X	28143	Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11034
Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1	Matsunami Glass	C022221
Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy	Merck Millipore	107961
MAS-coated slide glass white	Matsunami Glass	MI-MAS-01
Wooden Mappe KO-type	Shoei Work's	99-40007
Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml	Zeiss	444960
Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
Ultrapure water production system	Advantec	GS-590
Plastic glove, Star Nitrile Glove	Star	RSU-NGVM
Cryostat	Leica Microsystems	CM1950
Deep freezer, SANYO Ultra Low	Sanyo	MDF-382
Showcase refrigerator	Nihon Freezer	NC-ME50EC
Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)	Taitec	0068750-000
Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)	Taitec	HB-100
Incubation chamber for immunostaining	Cosmo Bio	10DO
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)	Taitec	NR-1
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)	Tokyo Rika Kikai	MMS-3010
Stereoscopic microscope (for tissue handling)	Olympus	SZ61
Stereoscopic microscope (for Figure 1B)	Leica Microsystems	M165FC
Fluorescence microscope (for Figure 3)	Nikon	E800
Confocal laser-scanning microscope	Zeiss	LSM700