रोग संकेत की एक विस्तृत विविधता के पार, और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल विकसित किया जा रहा है और दवा खोज कार्यक्रमों में लागू होता है । नए मॉडल प्रणाली यहां वर्णित कैसे तीन आयामी ट्यूमर spheroids और प्रसंस्कृत किया जा सकता है एक उच्च प्रवाह १५३६-अच्छी तरह से प्लेट में जांच के लिए नए कैंसर विज्ञान दवाओं के लिए खोज के आधार पर प्रदर्शित करता है ।
कैंसर की कोशिकाओं को नियमित रूप से एक प्लास्टिक की सतह पर दो आयामों (2d) में संस्कृति है । इस तकनीक, तथापि, सच है पर्यावरण एक ट्यूमर द्रव्यमान का अभाव vivo मेंउजागर होता है । ठोस ट्यूमर एक प्लास्टिक से जुड़ी चादर के रूप में नहीं हो जाना है, लेकिन बजाय एक तीन आयामी (3 डी) अंतरिक्ष में क्लोनिंग कोशिकाओं का एक संग्रह के रूप में अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत, और ऐसे सामांय सेलुलर ध्रुवीकरण के विघटन के रूप में विशिष्ट विशेष गुण के साथ । इन बातचीत के कारण 3 डी-कल्चरल कोशिकाओं रूपात्मक और सेलुलर विशेषताओं जो अधिक vivo ट्यूमर में करने के लिए प्रासंगिक है प्राप्त करने के लिए । इसके अतिरिक्त, एक ट्यूमर बड़े पैमाने पर अन्य कोशिका प्रकार जैसे stromal और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में है, साथ ही अन्य सभी प्रकार के सेल से extracellular मैट्रिक्स. मैट्रिक्स जमा अणुओं जैसे कोलेजन और fibronectin के रूप में शामिल है ।
चेन्नाई से बेडसाइड तक ऑन्कोलॉजी में शोध निष्कर्षों का अनुवाद बढ़ाने के प्रयास में कई समूहों ने अपनी औषध विकास रणनीतियों में 3डी मॉडल सिस्टम के इस्तेमाल की जाँच शुरू कर दी है. इन पद्धतियों को अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक माना जाता है क्योंकि वे एक ट्यूमर के जटिल और विषम वातावरण को दोहराऊंगा करने का प्रयास करते हैं. इन प्रणालियों, तथापि, काफी जटिल हो सकता है, और, हालांकि ९६ में विकास के लिए उत्तरदायी-अच्छी तरह से प्रारूपों, और कुछ अब भी ३८४ में, वे बड़े पैमाने पर विकास और स्क्रीनिंग के लिए कुछ विकल्प प्रदान करते हैं. यह स्वीकार्य अंतर १५३६ में एक उच्च प्रवाह क्षमता में संस्कृति ट्यूमर spheroids को विस्तार से यहां वर्णित तरीकों के विकास के लिए नेतृत्व किया है अच्छी तरह से प्लेटें । इन तरीकों अत्यधिक जटिल मैट्रिक्स के लिए एक समझौता-आधारित प्रणाली है, जो स्क्रीन के लिए मुश्किल है, और पारंपरिक 2 डी परख प्रतिनिधित्व करते हैं । विभिंन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों बंदरगाह कैंसर सेल लाइनों की एक किस्म को सफलतापूर्वक जांच कर रहे हैं, Mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे या MAPK मार्ग लक्ष्यीकरण यौगिकों के एक उपचारात्मक पुस्तकालय का उपयोग करके यौगिक प्रभावकारिता का परीक्षण । अंडाकार आकृति संस्कृति प्रतिक्रियाओं फिर 2d में उगाया कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की तुलना में कर रहे हैं, और विभेदक गतिविधियों की सूचना है । इन पद्धतियों एक उच्च-प्रवाह 3d सेटिंग में यौगिक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए एक अनंय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
पिछले एक दशक में, अधिक से अधिक अध्ययन 3 डी सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग के लिए अवधारणाओं कि प्लास्टिक पर 2d में कोशिकाओं को बढ़ने से पूरी तरह से recapitulated नहीं कर रहे है समझने के लिए लागू किया है । इन अवधारणाओं के उदाहरण सामांय उपकला कोशिका ध्रुवीयता1 में बारी है जहां शिखर और कोशिकाओं के बेसल परतों के स्थानिक अभिविन्यास खो रहे हैं, साथ ही अस्तित्व और कोशिका भाग्य को विनियमित करने में extracellular मैट्रिक्स की भूमिका शामिल हैं । ऑन्कोलॉजी अनुसंधान, विशेष रूप से, 3d मॉडल का इस्तेमाल किया है कैंसर कोशिकाओं के बुनियादी जीवविज्ञान और 2d और 3 डी सेल कल्चर सिस्टम3,4के बीच मतभेद को समझने के लिए । अधिक परिष्कृत सेल संस्कृति तकनीक और बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों के लिए उनके आगे अनुकूलन के विकास 3 डी सेटिंग्स में नई दवाओं के लिए खोज सक्षम है । 2 डी शर्तों के तहत हो कोशिकाओं के विपरीत, ट्यूमर के 3d मॉडल स्तरित सेलुलर सिस्टम से जटिलता में रेंज5 एकल सेल प्रकार के क्षेत्रों के लिए विभिंन आकारों, जटिल बहु सेल प्रकार6,7 क्षेत्रों के लिए, 8. उपंयास यौगिकों या तर्क है कि शक्तिशाली इन 3 डी मॉडल सिस्टम में सेल मौत प्रेरित की खोज है, इसलिए, दवा विकास अभियानों में उच्च ब्याज की । इन परख के अंतिमबिंदु अक्सर 2d संस्कृतियों में प्रदर्शन करने के लिए सेल प्रसार में परिवर्तन का आकलन उन लोगों के समान हैं, लेकिन जब एक और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में आयोजित, वे लक्ष्य जीन या मार्ग की निर्भरता का सही स्तर पर प्रकट हो सकता है पूछताछ.
के रूप में ऊपर शुरू की, मॉडल प्रणालियों की एक किस्म 3 डी संस्कृति प्रणालियों में दवा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन बहुमत या तो ९६ या ३८४-अच्छी तरह से microtiter प्लेट का उपयोग करें और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) प्रारूपों अक्सर उपयोग करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय नहीं कर रहे है ड्रग डिस्कवरी जांच अभियान । इस तरह के सिस्टम छोटी बूंद प्रौद्योगिकियों, अंडाकार आकृति संस्कृतियों, चुंबकीय कणों के साथ pulsating कोशिकाओं उत्तोलन प्रेरित करने के लिए, और ऐसी कोलेजन, Matrigel, या पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के रूप में प्राकृतिक या सिंथेटिक जैल शामिल संस्कृतियों के उपयोग में शामिल2 . यहां, हम एक पहले से विकसित तकनीक के विस्तृत तरीकों के लिए एक १५३६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में स्थापित कैंसर सेल लाइनों से 3 डी अंडाकार आकृति संस्कृतियों का उत्पादन प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, एक उच्च परिभाषित माध्यम का उपयोग किया जाता है जो सामान्य रूप से अनुयाई कक्ष पंक्तियाँ9के अनुलग्नक को रोकता है । इस प्रणाली की सीमाएं है (यानी, यह पूरी तरह से कैंसर की एक जटिल मॉडल प्रणाली दोहराऊंगा नहीं कर सकते हैं), लेकिन फिर भी, इन परख एक उच्च छोटे अणुओं और दवा की प्रतिक्रिया के crosswise तुलना के बड़े संग्रह का प्रवाह जांच सक्षम सेल लाइनों और यौगिकों की एक किस्म के खिलाफ 2d और 3 डी संस्कृतियों के बीच ।
सेल लाइनों इस लेख में सभी बंदरगाह उत्परिवर्तनों MAPK संकेतन मार्ग से संबंधित जीन में, एक मार्ग है जो अत्यधिक कैंसर में dysregulated है, और जिसके लिए कई चिकित्सकीय उपलब्ध है के तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए चुना है । लाइनों के कई कर्स्टन चूहे सार्कोमा वायरस में oncogenic उत्परिवर्तनों को सक्रिय किया है भी KRAS के रूप में जाना जाता है, Neuroblastoma रास या NRAS, हार्वे चूहे सार्कोमा वायरस oncogene या HRAS, और एसोसिएटेड kinases तेजी से त्वरित Fibrosarcomas, के रूप में भी जाना जाता RAFs । हाल के साहित्य पता चलता है कि इस मार्ग के विभिंन नोड्स के अवरोधकों जब 3 डी शर्तों9,10के तहत हो सेल लाइनों के एक सबसेट में विशिष्ट रूप से अधिक प्रभावोत्पादक हैं । एक अध्ययन में पाया गया कि जब सक्रिय रास के साथ कैंसर कोशिकाओं को 3 डी में संस्कृति थे, वे MAPK अवरोधकों के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया, और आगे, कि इस दृष्टिकोण रास्ते और लक्षित अवरोधकों कि पारंपरिक 2d में याद किया जा सकता है की पहचान सकता है सेटिंग. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए इन सेल लाइनों संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया तरीकों को पेश करने के लिए है, और आगे, इन अवरोधकों जो केवल जब 3 डी सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग कर मनाया जा सकता है के लिए विभेदक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन ।
यहां प्रस्तुत तरीकों को कैसे १५३६ में ट्यूमर spheroids उत्पादन के लिए अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर यौगिक प्रदर्शन के लिए प्लेटों पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है । इन तरीकों से शुरू में काम से अनुकू?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक के लिए अनुवाद विज्ञान, उनके समर्थन और इन परख के प्रारंभिक विकास पर मार्गदर्शन के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों को आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केंद्र में मार्क फेरर स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम एलिसन फ्रीमैन, Mariela Jaskelioff, माइकल अकर, जैकब Haling, और Vesselina Cooke उनके वैज्ञानिक इनपुट और परियोजना टीम के सदस्यों के रूप में चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Reagents | |||
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
Consumables | |||
Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
Equipment | |||
Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
Spinning Incubator | LiCONiC | ||
Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |