Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti
Summary
Attraverso un’ampia varietà di indicazioni di malattia, modelli più fisiologicamente rilevanti sono in corso programmi di scoperta della droga sviluppata e implementata in. Il nuovo modello di sistema descritto qui di seguito viene illustrato come tridimensionale del tumore sferoidi possono essere coltivate e proiettati in un sistema basato su piastra 1536 pozzetti ad alta produttività per la ricerca di nuovi farmaci oncologici.
Abstract
Le cellule tumorali hanno state coltivate ordinariamente in due dimensioni (2D) su una superficie di plastica. Questa tecnica, tuttavia, manca il vero ambiente un tumore massa è esposto a in vivo. Tumori solidi non come un foglio allegato al plastica crescono, ma invece come un insieme di cellule clonali in un tridimensionale (3D) spazio interagendo con i loro vicini e con proprietà distinte spaziali quali la rottura della polarità cellulare normale. Queste interazioni inducono le cellule coltivate in 3D di acquisire caratteristiche morfologiche e cellulari che sono più rilevanti per i tumori in vivo . Inoltre, un tumore massa è a diretto contatto con altri tipi cellulari come cellule stromale ed immuni, come pure la matrice extracellulare da tutti gli altri tipi di cella. La matrice depositata è composto da macromolecole come collagene e fibronectina.
Nel tentativo di aumentare la traduzione dei risultati della ricerca in oncologia dal banco al capezzale, molti gruppi hanno iniziato a studiare l’uso di sistemi di modello 3D nelle loro strategie di sviluppo della droga. Questi sistemi sono pensati per essere più fisiologicamente rilevanti perché tentano di ricapitolare l’ambiente complesso ed eterogeneo di un tumore. Questi sistemi, tuttavia, possono essere molto complessi, e, anche se suscettibili di crescita a 96 pozzetti formati e alcuni ora anche nel 384, che offrono alcune scelte per la crescita su larga scala e lo screening. Questo osservato gap ha portato allo sviluppo dei metodi descritti qui in dettaglio per cultura tumore sferoidi in una capacità di alto-rendimento in 1536 pozzetti. Questi metodi rappresentano un compromesso ai sistemi basati su matrice altamente complessi, che sono difficili da schermo e le analisi 2D convenzionale. Una varietà di linee cellulari del cancro che harboring le mutazioni genetiche differenti vengono proiettati con successo, esaminando l’efficacia composto utilizzando una libreria a cura di composti targeting pathway della chinasi di proteina mitogen o MAPK. Le risposte di cultura sferoide sono quindi confrontate con la risposta delle cellule coltivate in 2D, e attività differenziale sono segnalati. Questi metodi forniscono un protocollo unico per il test composto attività in un ambiente 3D di alto-rendimento.
Introduction
Nell’ultimo decennio, sempre più studi hanno implementato l’utilizzo di modelli di coltura cellulare 3D a capire concetti che non sono completamente ricapitolati coltivando cellule in 2D su plastica. Esempi di questi concetti includono le alternanze in normale delle cellule epiteliali polarità1 dove vengono perse l’orientamento spaziale degli strati apicali e basali delle cellule, come pure il ruolo della matrice extracellulare nella regolazione della sopravvivenza e il destino della cellula. Ricerca oncologica, in particolare, ha utilizzato modelli 3D per capire la biologia delle cellule tumorali e le differenze tra 2D e 3D cell culture sistemi3,4. Lo sviluppo delle più sofisticate tecniche di coltura cellulare e loro ulteriore adattamento a formati multi-pozzetto ha permesso la ricerca di nuovi farmaci in impostazioni 3D. Contrariamente alle cellule coltivate in condizioni 2D, modelli 3D di fascia di tumori nella complessità da sistemi cellulari stratificati5 per singolo-cellula-tipo sfere di diverse dimensioni, a complessi multi-cell-tipo sfere6,7, 8. la scoperta di nuovi composti o biologics che potente inducono la morte delle cellule in questi sistemi di modello 3D è, pertanto, di grande interesse in campagne di sviluppo della droga. Endpoint di queste analisi sono spesso identiche a quelle eseguite in 2D culture per valutare i cambiamenti nella proliferazione delle cellule, ma quando condotto in un ambiente più fisiologicamente rilevante, possono rivelare il vero livello di dipendenza del gene bersaglio o via essendo interrogato.
Come introdotto sopra, una varietà di sistemi di modello sono stati sviluppati per lo studio delle risposte farmacologiche in sistemi di coltura 3D, ma la maggior parte utilizza entrambi piastre di microtitolazione 96 o 384 pozzetti e non è facilmente adattabile ai formati high throughput screening (HTS) spesso usati in campagne di screening scoperta della droga. Tali sistemi prevedono l’utilizzo di tecnologie di goccia, culture sferoide, palpitazione cellule con particelle magnetiche per indurre la levitazione e culture che incorporano gel naturali o sintetici, quali collagene, Matrigel o polietilenglicole (PEG)2 per appendere . Qui, presentiamo i metodi dettagliati di una tecnica precedentemente sviluppata per produrre colture di sferoide 3D da linee cellulari di cancro stabilito in un formato di 1536 pozzetti. In questo protocollo, viene utilizzato un mezzo altamente definito che impedisce l’attacco di cellulari normalmente aderenti linee9. Questo sistema presenta limitazioni (vale a dire, essa non può ricapitolare completamente un sistema complesso modello di cancro), ma ciò nonostante, queste analisi permettono uno screening ad alta resa di grandi collezioni di piccole molecole e traverso comparazioni di risposta ai farmaci tra 2D e 3D culture contro una varietà di linee cellulari e composti.
Le linee cellulari selezionati per illustrare i metodi in questo articolo tutte le porto mutazioni in geni correlati per il via, una via che è altamente dysregulated in cancro, di segnalazione MAPK e per cui molte terapie sono disponibili. Molte delle linee hanno attivazione mutazioni oncogeniche in Kirsten Rat Sarcoma virus indicato anche come KRAS, il RAS di Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus Harvey Rat Sarcoma o HRA e le chinasi associate rapidamente accelerato Fibrosarcomas, conosciuto anche come RAFs. Letteratura recente suggerisce che gli inibitori di diversi nodi di questa via sono univocamente più efficaci in un sottoinsieme delle linee cellulari quando coltivate in condizioni 3D9,10. Uno studio ha trovato che quando le cellule tumorali con RAS attivo sono state coltivate in 3D, ha dimostrato una maggiore sensibilità agli inibitori MAPK e inoltre, che questo approccio potrebbe identificare vie e inibitori che potrebbero essere perso in 2D tradizionale e mirata l’impostazione. L’obiettivo di questo studio è di presentare i metodi utilizzati per la coltura di queste linee cellulari, e ulteriormente, per dimostrare il differenziale risposte a questi inibitori che possono essere osservati solo quando si utilizza 3D delle cellule sistemi di coltura.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi presentati qui dimostrano un protocollo dettagliato su come produrre sferoidi di tumore nel 1536 pozzetti per proiezioni su larga scala di composti. Questi metodi sono stati inizialmente adattati dal lavoro presso il National Cancer Institute dove sferoidi del tumore sono state coltivate in saggi di basso-velocità di trasmissione in 6 pozzetti e 96 pozzetti piastre per porre domande su dipendenze genetiche e sensibilità composto13, 14 , <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare Marc Ferrer al centro nazionale per le scienze traslazionale avanzando, National Institutes of Health per il supporto e la guida sullo sviluppo iniziale di queste analisi. Inoltre, vorremmo ringraziare Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling e Vesselina Cooke per il contributo scientifico e la discussione come membri del team di progetto.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
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