التقييم السريري بيواكتيفيتي OT48 الكومارين السرطان الماغنيسيوم وفحوصات تشكيل مستعمرة، وتكثيفها الزرد
Summary
وهنا، نقدم الفحص السريري من السرطان كومارينس استخدام الثقافة 3D والزرد.
Abstract
فحص ما قبل السريرية في المختبر و في فيفو من العوامل العلاجية الرواية أداة أساسية في اكتشاف الأدوية السرطان. على الرغم من أن خطوط خلايا السرطان البشرية تستجيب للمركبات العلاجية في 2D أحادي الطبقة (الأبعاد) خلية الثقافات، وضعت نظم الثقافة 3D لفهم مدى فعالية العقاقير في النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. في السنوات الأخيرة، لوحظ تحولاً نموذجياً في البحوث السريرية قبل التحقق من فاعلية الجزيئات الجديدة في نظم الثقافة 3D، ومحاكاة أكثر دقة وورم المكروية. هذه الأنظمة تميز حالة المرض بطريقة أكثر فسيولوجيا ذات صلة وتساعد على اكتساب أفضل آليا إلى المعرفة والفهم للفاعلية الدوائية لجزيء معين. وعلاوة على ذلك، ومع الاتجاه الحالي في تحسين نماذج السرطان في فيفو ، برز الزرد فقاريات نموذجا هاما لتقييم في فيفو تشكيل الورم ودراسة أثر العوامل العلاجية. هنا، نحن التحقيق في الفعالية العلاجية هيدروكسيكومارين OT48 وحدها أو في تركيبة مع mimetics BH3 في خط خلية سرطان الرئة A549 باستخدام ثلاثة نظم الثقافة 3D مختلفة بما في ذلك فحوصات تشكيل مستعمرة (CFA)، كروي تشكيل المقايسة (SFA) و في فيفو تكثيفها الزرد.
Introduction
سرطان ناجم عن الطفرات الخلوية، ونتيجة لذلك تتعطل مسارات الإشارات البيوكيميائية تسبب في انقسام الخلايا غير المنضبط والمقاومة لموت الخلايا. أورام تتداخل مع الوظائف الفسيولوجية لنظم الدورة الدموية، الجهاز الهضمي والجهاز العصبي، و الأنسجة المجاورة في وقت لاحق1. وعلى الرغم من الجهود البحثية واسعة النطاق، يظل السرطان أمراض تهدد الحياة الأكثر انتشارا في العالم2. اعترف الطب الدقيقة كأساس لعلاجات السرطان مستقبلا. الكيانات الجزيئية الجديدة يتم اختبارها بشكل روتيني في تركيبة مع العقاقير الموجودة لتحسين النتائج السريرية.
ومع ذلك، أحد القيود الهامة المرتبطة بتطوير علاجات جديدة تستهدف كفاءة هو فشل الاختبارات المستخدمة عادة لمحاكاة نتائج البيولوجية الدقيقة للمخدرات التعرض3. اكتشاف المخدرات السرطان لا يزال معظمها يعتمد على اختبار فعالية العوامل العلاجية في خطوط خلايا السرطان المستزرعة في 2D أحادي الطبقة الثقافات، مما يصعب من التحقق من صحة في التجارب السريرية4. ولذلك، هناك اهتمام متزايد بتطوير نماذج سرطان أفضل تقليد أفضل الميزات الأصلية للأورام في فيفو5. في السنوات الأخيرة، أدى اهتمام متزايد في نماذج الثقافة 3D تطوير المنهجيات المحسنة لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد الورم5.
نقدم هنا، هو نهج مع ثلاث تقنيات استزراع خلية 3D مختلفة مما يسمح بتحسين فهم فاعلية هيدروكسيكومارين OT486 في تركيبة مع mimetics BH3 قبل أكثر في العمق في فيفو فحوصات. يتكون لدينا طريقة للجمع بين مستعمرة وسفاس مع فيفو ورم تشكيل اختبار استناداً إلى نموذج الزرد لمواصلة التحقق من فعالية الجمع بين mimetics OT48 و BH3 في خلايا سرطان الرئة، ورصد تطور السرطان في العيش الكائن الحي.
وتستخدم بشكل روتيني فحوصات تشكيل مستعمرة لتقييم فعالية عوامل السرطان للسرطان سواء الصلبة وكذلك المكونة للدم. الإنزيم يحدد قدرة خلية تتكاثر إلى أجل غير مسمى وتشكيل المستعمرات7. أثر عامل السرطان على المستعمرة تشكل قدرة الخلايا يتحدد بخفض عدد و/أو حجم المستعمرات.
تمثل نماذج في المختبر الورم الماغنيسيوم وتكون بمثابة منصة فحص منخفضة التكلفة لوكلاء السرطان. الماغنيسيوم مجاميع خلايا تنمو في تعليق أو مضمن في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. وهذا النهج يستخدم على نطاق واسع لفحص المخدرات ودراسات للورم النمو والانتشار والمناعة التفاعل8.
لفهم خصائص دواء جديد تماما، من الضروري إجراء تجارب في فيفو على القوارض. ومع ذلك، هذه الطريقة التقليدية مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. وفي السنوات الأخيرة، أصبح الزرد (دانيو rerio) كائن مختبر دراسة على نطاق واسع هو أرخص وأسرع لرفع. تطوير أورام في نهج الثقافة الخلية تمثل 3D الزرد ولكن ضمن الإعداد في فيفو من الفقاريات9.
بالإجمال، نحن نستخدم هنا ثلاثة نهج ثقافة 3D مختلفة منها الماليين وسفاس الزرد في فيفو تشكيل الورم لإثبات قدرة السرطان هيدروكسيكومارين OT48 في نموذج خلية A549 سرطان الرئة في تركيبة مع BH3 mimetics.
Protocol
Representative Results
Discussion
معدلات تكوين مستعمرة الحصول عليها مع مكبم يعتمد على نوع الخلية. عادة، هو عدد المستعمرات للخلايا غير ملتصقة، أعلى بكثير مقارنة بالخلايا ملتصقة. ولاحظنا أن خلايا A549 شكلت مستعمرات 30 إلى 40 بعد 10 أيام. سابقا قد أبلغنا لخلايا اللوكيميا المختلفة أن عدد المستعمرات ما بين 200 إلى 2509. وأظ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البحث في SNU معتمد من قبل مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني) من MEST كوريا لمنحه ورم المكروية العالمية الأساسية البحث مركز (جكرك)، [عدد المنح 2011-0030001]؛ منحة بحثية الجامعة الوطنية في سيول، والدماغ كوريا (BK21) بالإضافة إلى ذلك البرنامج.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
