Spheroids, कॉलोनी के गठन की परख, और Zebrafish Xenografts द्वारा विरोधी अनंतमूलि OT48 की सी गतिविधि के नैदानिक मूल्यांकन
Summary
यहां, हम 3 डी संस्कृति और zebrafish का उपयोग कर विरोधी coumarins के नैदानिक स्क्रीनिंग प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
इन विट्रो में और vivo पूर्व नैदानिक स्क्रीनिंग उपंयास चिकित्सीय एजेंटों के कैंसर की दवा खोज में एक आवश्यक उपकरण हैं । हालांकि मानव कैंसर कोशिका लाइनों 2d (आयामी) monolayer सेल संस्कृतियों में चिकित्सीय यौगिकों का जवाब, 3 डी संस्कृति प्रणालियों और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडलों में दवाओं की प्रभावकारिता को समझने के लिए विकसित किया गया । हाल के वर्षों में, एक बदलाव पूर्व में मनाया नैदानिक अनुसंधान के लिए 3 डी संस्कृति प्रणालियों में नए अणुओं की शक्ति को मांय किया गया था, और अधिक ठीक ट्यूमर microenvironment नकल उतार । इन प्रणालियों एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक तरीके से रोग राज्य विशेषताएं और बेहतर यंत्रवत अंतर्दृष्टि और एक दिया अणु की औषधीय शक्ति की समझ हासिल करने में मदद । इसके अलावा, vivo कैंसर मॉडल में सुधार लाने में मौजूदा रुझान के साथ, zebrafish एक महत्वपूर्ण हड्डीवाला मॉडल के रूप में vivo ट्यूमर के गठन में मूल्यांकन और चिकित्सकीय एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उभरा है । यहां, हम hydroxycoumarin OT48 अकेले या फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन A549 में BH3 mimetics के साथ संयोजन में कॉलोनी गठन की परख सहित तीन अलग 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करके की चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच की, अंडाकार आकृति गठन परख (SFA) और में vivo zebrafish xenografts.
Introduction
कैंसर सेलुलर उत्परिवर्तनों के कारण होता है और एक परिणाम के रूप में जैव रासायनिक संकेत रास्ते अनियंत्रित कोशिका विभाजन और कोशिका मृत्यु के लिए प्रतिरोध को ट्रिगर बाधित कर रहे हैं । ट्यूमर पाचन, तंत्रिका, संचार प्रणालियों और बाद में पड़ोसी ऊतकों के शारीरिक कार्यों के साथ हस्तक्षेप1. व्यापक अनुसंधान प्रयासों के बावजूद, कैंसर दुनिया में सबसे अधिक प्रचलित जीवन-धमकी रोग2रहता है । प्रेसिजन चिकित्सा भविष्य कैंसर चिकित्सकीय की नींव के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । नई आणविक संस्थाओं नियमित रूप से मौजूदा दवाओं के साथ संयोजन में परीक्षण कर रहे है नैदानिक परिणाम में सुधार होगा ।
हालांकि, महत्वपूर्ण नई कुशल लक्षित चिकित्सा के विकास के साथ जुड़े सीमाओं में से एक आमतौर पर इस्तेमाल किया परख की विफलता के लिए दवा जोखिम3के सटीक जैविक परिणाम अनुकरण है । कैंसर की दवा खोज अभी भी ज्यादातर कैंसर सेल में चिकित्सकीय एजेंटों की प्रभावकारिता परीक्षण पर निर्भर करता है 2 डी monolayer संस्कृतियों, जो नैदानिक परीक्षणों4में मांय करने के लिए मुश्किल है संस्कृति लाइनों में । इसलिए बेहतर कैंसर मॉडल विकसित करने के लिए रुचि बढ़ रही है जो वीवो5में ट्यूमर की देशी सुविधाओं की बेहतर नकल है । हाल के वर्षों में, 3 डी संस्कृति मॉडल में एक बढ़ती ब्याज 3 डी ट्यूमर मॉडल5का उत्पादन करने के लिए सुधार के तरीके के विकास के परिणामस्वरूप ।
यहां, हम तीन अलग 3 डी सेल संस्कृति के साथ एक दृष्टिकोण वर्तमान BH3 mimetics के साथ संयोजन में hydroxycoumarin OT486 की शक्ति की समझ में सुधार की अनुमति के लिए और अधिक से पहले vivo परख में गहराई में । हमारा तरीका एक zebrafish मॉडल पर आधारित एक vivo ट्यूमर गठन परीक्षण में एक के साथ कॉलोनी और SFAs संयोजन के होते हैं और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में OT48 और BH3 mimetics के संयोजन की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए और एक जीवित में कैंसर प्रगति की निगरानी जीव.
कॉलोनी गठन परख नियमित रूप से दोनों के लिए ठोस के रूप में अच्छी तरह से टेम कैंसर के लिए विरोधी एजेंटों की प्रभावकारिता का आकलन किया जाता है । परख एक सेल की क्षमता को अनिश्चित काल के पैदा करना और फार्म कालोनियों7निर्धारित करता है । कोशिकाओं की कॉलोनी बनाने की क्षमता पर एक विरोधी एजेंट के प्रभाव की संख्या में कमी और कालोनियों के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
Spheroids इन विट्रो ट्यूमर मॉडल में प्रतिनिधित्व करते हैं और विरोधी एजेंटों के लिए एक कम लागत वाली स्क्रीनिंग मंच के रूप में काम करते हैं । Spheroids निलंबन में बढ़ रही है या एक 3 डी मैट्रिक्स में एंबेडेड कोशिकाओं के समुच्चय हैं । इस दृष्टिकोण व्यापक रूप से दवा स्क्रीनिंग और ट्यूमर के विकास, प्रसार और प्रतिरक्षा संपर्क8के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है ।
एक नई दवा के गुणों को पूरी तरह समझने के लिए, यह कुतर पर vivo प्रयोगों में आयोजित करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, इस पारंपरिक विधि महंगा है और समय लगता है । हाल के वर्षों में, zebrafish (ढाणियो rerio) एक व्यापक रूप से अध्ययन प्रयोगशाला जीव है कि सस्ता और तेजी से बढ़ा है बन गया । ट्यूमर zebrafish में विकसित एक 3 डी सेल संस्कृति दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन एक हड्डीवाला9की सेटिंग में वीवो के भीतर ।
कुल मिलाकर, हम यहां CFAs, SFAs और vivo ट्यूमर गठन में zebrafish सहित तीन अलग 3 डी संस्कृति दृष्टिकोण का उपयोग hydroxycoumarin OT48 के संयोजन में एक फेफड़ों के कैंसर A549 सेल मॉडल में BH3 mimetics की क्षमता विरोधी प्रदर्शन करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
MCBM के साथ प्राप्त कॉलोनी गठन की दरें कोशिका प्रकार पर निर्भर करती हैं. आमतौर पर, गैर अनुयाई कोशिकाओं के लिए, अनुयाई कोशिकाओं की तुलना में कालोनियों की संख्या बहुत अधिक है । हमने देखा है कि A549 कोशिकाओं को 10 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SNU में अनुसंधान ट्यूमर Microenvironment ग्लोबल कोर रिसर्च सेंटर (GCRC) अनुदान के लिए कोरिया के MEST द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा समर्थित है, [अनुदान संख्या 2011-0030001]; सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट और ब्रेन कोरिया (BK21) प्लस प्रोग्राम द्वारा ।
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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