Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish
Summary
Qui, presentiamo lo screening preclinico di cumarine anticancro utilizzando zebrafish e cultura 3D.
Abstract
Lo screening pre-clinico in vitro e in vivo di nuovi agenti terapeutici sono uno strumento essenziale nella scoperta della droga di cancro. Anche se linee cellulari tumorali umane rispondono ai composti terapeutici nelle colture delle cellule dello strato monomolecolare (dimensionali) 2D, 3D cultura sistemi sono stati sviluppati per comprendere l’efficacia delle droghe nei modelli più fisiologicamente rilevanti. Negli ultimi anni, un cambiamento di paradigma è stata osservata in ricerca pre-clinica per convalidare la potenza di nuove molecole in sistemi di coltura 3D, più precisamente che imita il microambiente tumorale. Questi sistemi caratterizzano lo stato di malattia in un modo più fisiologicamente rilevante e aiutano ad per acquisire meglio meccanicistico conoscenza e la comprensione della potenza farmacologica di una data molecola. Inoltre, con l’attuale tendenza al miglioramento in vivo modelli del cancro, zebrafish è emerso come un importante modello di vertebrati di valutare in vivo la formazione del tumore e di studiare l’effetto degli agenti terapeutici. Qui, abbiamo studiato l’efficacia terapeutica di hydroxycoumarin OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetics nella linea cellulare di cancro del polmone delle cellule A549 utilizzando tre sistemi differenti della coltura 3D tra cui saggi di formazione di Colonia (CFA), analisi di formazione della sferoide (SFA) e in vivo gli xenotrapianti zebrafish.
Introduction
Il cancro è causato da mutazioni cellulari e di conseguenza pathway biochimici sono interrotti innescando la divisione cellulare incontrollata e resistenza alla morte cellulare. I tumori interferiscano con funzioni fisiologiche dell’apparato digerente, nervoso, circolatorio e successivamente vicini tessuti1. Nonostante gli sforzi di ricerche approfondite, il cancro rimane la malattia pericolosa più diffusa nel mondo2. Medicina di precisione è stato riconosciuto come il fondamento della terapeutica del cancro futuro. Nuove entità molecolari sono testate regolarmente in combinazione con farmaci già esistenti per migliorare il risultato clinico.
Tuttavia, uno dei limiti significativi connessi con lo sviluppo di nuove terapie mirate efficiente è il fallimento di analisi comunemente usati per simulare il risultato biologico esatto della droga dell’esposizione3. Scoperta della droga di cancro ancora in gran parte si basa su test l’efficacia degli agenti terapeutici in linee cellulari tumorali coltivate in colture monostrato 2D, che sono difficili da convalidare in studi clinici4. Di conseguenza, c’è un crescente interesse a sviluppare modelli migliori di cancro che meglio simulano le funzionalità native di tumori in vivo5. Negli ultimi anni, un crescente interesse nei modelli 3D cultura ha provocato lo sviluppo di metodologie di miglioramento per produrre tumore 3D modelli5.
Qui, presentiamo un approccio con tre tecniche di coltura differenti delle cellule 3D che permette di migliorare la comprensione della potenza di hydroxycoumarin OT486 in combinazione con BH3 mimetics prima più in profondità in vivo saggi. Il nostro metodo consiste di combinazione di Colonia e SFAs con un in vivo del tumore formazione test basato su un modello di zebrafish ulteriormente convalidare l’efficacia della combinazione di OT48 e BH3 mimetici in cellule di cancro del polmone e monitorare la progressione del cancro in una vita organismo.
Saggi di formazione di Colonia sono abitualmente utilizzati per valutare l’efficacia di farmaci antitumorali per i tumori sia solidi, nonché ematopoietici. Il test determina la capacità di una cellula a proliferare indefinitamente e formano colonie7. L’effetto di un agente anticancro sulla capacità delle cellule di formazione di colonie è determinata dalla diminuzione del numero e/o dimensioni delle colonie.
Sferoidi rappresentano modelli di tumore in vitro e servono come una piattaforma di screening a basso costo per agenti anticancro. Sferoidi sono aggregati di cellule che crescono in sospensione o incorporati in una matrice 3D. Questo approccio è ampiamente usato per lo screening di stupefacenti e gli studi di tumore crescita, proliferazione e immunitario interazione8.
Per comprendere appieno le proprietà di un nuovo farmaco, è essenziale per condurre esperimenti in vivo su roditori. Tuttavia, questo metodo convenzionale è costoso e richiede tempo. Negli ultimi anni, zebrafish (Danio rerio) è diventato un organismo laboratorio ampiamente studiati che è più economico e più veloce per aumentare. Tumori si sono sviluppati nell’approccio di coltura cellulare di zebrafish rappresentano un 3D, ma all’interno della regolazione in vivo di un vertebrato9.
Complessivamente, usiamo qui tre approcci diversi cultura 3D tra cui CFAs, SFAs e formazione di zebrafish in vivo del tumore per dimostrare la capacità anticancro di hydroxycoumarin OT48 in un modello cellulare di cancro delle cellule A549 polmone in combinazione con BH3 mimetici.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tassi di formazione della Colonia ottenuti con MCBM dipende dal tipo delle cellule. Di solito, per cellule non aderenti, il numero di colonie è molto superiore rispetto a cellule aderenti. Abbiamo osservato che le cellule A549 formano colonie di 30 a 40 dopo 10 giorni. Precedentemente abbiamo segnalato per le cellule di leucemia differenti che il numero di colonie è compreso tra 200-2509. I nostri risultati hanno mostrato che OT48 da solo non ha prodotto una diminuzione significativa del numer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca presso SNU è sostenuta da Fondazione nazionale per la ricerca (NRF) MEST di Corea per concessione di tumore microambiente Global Core Research Center (GCRC), [numero di grant 2011-0030001]; da la Seoul National University Research Grant e dal cervello Corea (BK21) oltre a programma.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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