Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가
Summary
여기, 선물이 3D 문화와 제 브라를 사용 하 여 항 암 제 coumarins의 전 임상 심사.
Abstract
생체 외에서 그리고 vivo에서 새로운 치료제의 전 임상 심사 암 약물 발견에 필수적인 도구입니다. 비록 인간의 암 세포 선 2 차원 (차원) 단층 세포 배양에서 치료 화합물에 대응, 더 순수 관련 모델에서 약물의 효능을 이해 하 3 차원 배양 시스템 개발 되었다. 최근 몇 년 동안, 패러다임의 변화는 3D 문화 시스템, 더 정확 하 게 종양 microenvironment를 흉내 낸 새로운 분자의 힘을 확인 하기 위해 전 임상 연구에서 관찰 되었다. 이러한 시스템 보다 생리 적으로 관련 된 방식으로 질병 상태를 특성화 하 고 더 나은 기계적 통찰력 및 주어진된 분자의 약리 효능을 이해 하는 데 도움이. 또한, 암 모델 vivo에서 개선 추세와 함께 zebrafish vivo에서 종양의 형성을 평가 하 고 치료제의 효과 연구 하는 중요 한 척추 모델로 떠오르고 있다. 여기, 우리 조사 hydroxycoumarin OT48의 치료 효능 하거나 폐 암 세포 라인 A549 BH3 mimetics와 함께 식민지 대형 분석 실험 (CFA), 회전 타원 체 형성 분석 결과 (SFA) 등 세 가지 다른 3D 문화 시스템을 사용 하 여 및 zebrafish xenografts vivo에서 .
Introduction
암은 세포 돌연변이 의해 발생 하 고 결과적으로 생 화 확 적인 신호 경로 통제 세포 분열 및 세포 죽음에 저항을 트리거링 혼란 된다. 종양 소화, 신경, 순환 시스템 및 이후에 이웃 조직1의 생리 기능을 방해합니다. 광범위 한 연구 노력에도 불구 하 고 암2세계 가장 널리 퍼진 생명이 질병에 남아 있다. 정밀 의학 미래 암 치료의 기초로 인식 하고있다. 임상 결과 개선 하기 위해 기존 약물과 함께에서 새로운 분자 엔티티를 정기적으로 테스트 합니다.
그러나, 새로운 효율적인 표적으로 한 치료의 개발과 관련 된 중요 한 제한 중 약물 노출3의 정확한 생물 학적 결과 시뮬레이션 하기 위해 일반적으로 사용 되는 분석의 실패 이다. 암 약물 발견 여전히 대부분 암 세포 선에서4임상 시험 확인 하기 어려운 차원 단층 문화에서 교양 치료제의 효능을 테스트에 의존 합니다. 따라서, 더 나은 종양 vivo에서5의 기본 기능을 모방 하는 더 나은 암 모델을 개발 하는 관심이 있다. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 모델에 증가 관심 3D 종양 모델5생산 향상된 방법론의 개발에 결과.
여기, 우리는 깊이 비보에 분석 실험에 함께 더 전에 BH3 mimetics hydroxycoumarin OT486 의 힘의 이해를 향상 시킬 수 있도록 세 개의 다른 3D 셀 문화 기술로 접근을 제시. 우리의 방법은 식민지 및 SFAs는 vivo에서 종양 형성에 따라 검사 추가 폐 암 세포에서 OT48 및 BH3 mimetics의 조합의 효능을 확인 하 고 생활에서 암 진행 모니터링 zebrafish 모델에 결합의 구성 유기 체입니다.
식민지 대형 분석 실험 정기적으로 모두 고체 뿐만 아니라 조 혈 암에 대 한 항 암 제의 효능을 평가 하는 데 사용 됩니다. 분석 결과 무한정 증식 하 고 식민지7을 형성 하는 세포의 능력을 결정 합니다. 셀의 능력을 형성 하는 식민지에는 항 암 제의 효과 수의 감소 및 식민지의 크기에 의해 결정 됩니다.
Spheroids 종양 모델 생체 외에서 나타내고 제 에이전트는 저가 심사 플랫폼 역할. Spheroids는에 성장 하는 셀의 집계 또는 3D 매트릭스에 포함 된. 이 접근은 마약 검사 및 종양 성장, 확산 및 면역 상호 작용8의 연구에 널리 사용 됩니다.
완전히 새로운 약물의 속성 이해, vivo에서 실험 설치류에 필수적 이다. 그러나,이 전통적인 메서드는 비용과 시간이 소요 됩니다. 최근 몇 년 동안, zebrafish (Danio rerio) 널리 공부 실험실 유기 체를 저렴 하 고 빠르게 인상 되었다. 종양은 zebrafish 대표 3D 셀 문화 접근에서 하지만 척추9의 vivo에서 설정 내에서 개발.
전부, 사용 여기 CFAs, SFAs zebrafish vivo에서 종양 형성 등 3 가지 3D 문화 접근 BH3 mimetics 함께에서 폐 암 A549 세포 모델에서 hydroxycoumarin OT48의 항 암 제 용량을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCBM으로 얻은 식민지 형성의 속도 셀 형식에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 비 부착 한 세포에 대 한 식민지의 수는 부착 세포에 비해 훨씬 높은. 우리가 관찰 A549 세포 10 일 후 30 ~ 40 식민지를 형성 했다. 이전 우리 보고 다른 백혈병 세포에 대 한 식민지의 수 200 ~ 2509사이입니다. 우리의 결과 OT48 혼자 혼자 식민지의 수의 상당한 감소를 생성 하지 않았다 보여주었다. 그러나, BH3 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
서울대에서 연구는 종양 Microenvironment 글로벌 핵심 연구 센터 (GCRC) 그랜트, [허가 번호 2011-0030001];에 대 한 한국 개 국립 연구 재단 (NRF)에 의해 지원 됩니다. 서울 국가 대학 연구 보조금 및 두뇌 한국 (BK21) 프로그램 플러스.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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