Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

요약

여기, 선물이 3D 문화와 제 브라를 사용 하 여 항 암 제 coumarins의 전 임상 심사.

초록

생체 외에서 그리고 vivo에서 새로운 치료제의 전 임상 심사 암 약물 발견에 필수적인 도구입니다. 비록 인간의 암 세포 선 2 차원 (차원) 단층 세포 배양에서 치료 화합물에 대응, 더 순수 관련 모델에서 약물의 효능을 이해 하 3 차원 배양 시스템 개발 되었다. 최근 몇 년 동안, 패러다임의 변화는 3D 문화 시스템, 더 정확 하 게 종양 microenvironment를 흉내 낸 새로운 분자의 힘을 확인 하기 위해 전 임상 연구에서 관찰 되었다. 이러한 시스템 보다 생리 적으로 관련 된 방식으로 질병 상태를 특성화 하 고 더 나은 기계적 통찰력 및 주어진된 분자의 약리 효능을 이해 하는 데 도움이. 또한, 암 모델 vivo에서 개선 추세와 함께 zebrafish vivo에서 종양의 형성을 평가 하 고 치료제의 효과 연구 하는 중요 한 척추 모델로 떠오르고 있다. 여기, 우리 조사 hydroxycoumarin OT48의 치료 효능 하거나 폐 암 세포 라인 A549 BH3 mimetics와 함께 식민지 대형 분석 실험 (CFA), 회전 타원 체 형성 분석 결과 (SFA) 등 세 가지 다른 3D 문화 시스템을 사용 하 여 및 zebrafish xenografts vivo에서 .

서론

암은 세포 돌연변이 의해 발생 하 고 결과적으로 생 화 확 적인 신호 경로 통제 세포 분열 및 세포 죽음에 저항을 트리거링 혼란 된다. 종양 소화, 신경, 순환 시스템 및 이후에 이웃 조직¹의 생리 기능을 방해합니다. 광범위 한 연구 노력에도 불구 하 고 암²세계 가장 널리 퍼진 생명이 질병에 남아 있다. 정밀 의학 미래 암 치료의 기초로 인식 하고있다. 임상 결과 개선 하기 위해 기존 약물과 함께에서 새로운 분자 엔티티를 정기적으로 테스트 합니다.

그러나, 새로운 효율적인 표적으로 한 치료의 개발과 관련 된 중요 한 제한 중 약물 노출³의 정확한 생물 학적 결과 시뮬레이션 하기 위해 일반적으로 사용 되는 분석의 실패 이다. 암 약물 발견 여전히 대부분 암 세포 선에서⁴임상 시험 확인 하기 어려운 차원 단층 문화에서 교양 치료제의 효능을 테스트에 의존 합니다. 따라서, 더 나은 종양 vivo에서⁵의 기본 기능을 모방 하는 더 나은 암 모델을 개발 하는 관심이 있다. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 모델에 증가 관심 3....

프로토콜

1. 식민지 대형 분석 실험

1. 20000 셀/cm² RPMI1640의 15 ml에서의 농도에서 문화 A549 세포 세포 배양 10 보충 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 37 ° C, 5% CO₂CO₂ 배양 기에서 75 c m² 플라스 크에 1% 항생제.
2. 실험의 날에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 7 분 400 x g 에서 원심 분리 하 여 50, 000 셀을 수집 하 고 다시 1 x 살 균 PBS (인산 염 버퍼) 1.5 mL 튜브에의 100 µ L에서 세포를 일시 중단.
3. multipipette와 함께 15 mL 튜브에서 반 고체 스 기반 매체 (MCBM)의 1.1 mL을 분배. 각 조건에 대 한 튜브를 준비 합니다.
4. P200 micropipette를 사용 하 여 MCBM의 1.1 ml FBS의 110 µ L를 추가 합니다.
5. 1, 000 셀/mL에서 씨앗 셀입니다. 재고 솔루션 (50000 셀 1 x PBS의 100 µ L)에서 2.4 µ L 세포 현 탁 액의 수집 P2 micropipette 사용 하 고 10% 보충 하는 M....

결과

그림 2, 폐암 A549 했다 시드 MCBM에서 식민지를 형성 하 OT48와 치료 후 또는 표시 농도에서 BH3 모방 A1210477와 선 세포. 결과 조합 크게 감소 번호, 크기 및 식민지의 총 면적 외피의 10 일 후에 나타났다.

그림 3에서는 A549 세포 BH3 모방 A1210477와 혼자 또는 조합에서 OT48로 치료 했다 고 양식 spheroids U-하단 플레이트 기술에 의해 허용 되었다. 3 일 후 부 화, spheroids의 이미지 촬영 했다. spheroids의 정량화 이루어졌다 이미지 J 및 3D를 사용 하 여 이미지 생성 된.

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토론

MCBM으로 얻은 식민지 형성의 속도 셀 형식에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 비 부착 한 세포에 대 한 식민지의 수는 부착 세포에 비해 훨씬 높은. 우리가 관찰 A549 세포 10 일 후 30 ~ 40 식민지를 형성 했다. 이전 우리 보고 다른 백혈병 세포에 대 한 식민지의 수 200 ~ 250⁹사이입니다. 우리의 결과 OT48 혼자 혼자 식민지의 수의 상당한 감소를 생성 하지 않았다 보여주었다. 그러나, BH3 함께에서 A549 세포의 모방 A1210477 식민지 형성 능력 synergistically 감소 되었다. 이전 우리는 다른 hydroxycoumarin 파생 A549 세포의 식민지 형성 능력을 억제 하기 위해 또한 BH3 mimetics와 synergized OT52 보고. 제안 된 시드 농도 1.5 x 10을 1 x 10³ 에서 다를 수 있습니다³. CFA MethoCult를 사용 하 여 정기적으로 측정 하는 tumorigenesi.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강>집락 형성 분석에 필요한 재료
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	론자	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500-20	C°
페니실린-스트렙토마이신	Lonza	17-602E-20	C°
세포 배양 플라스크 T75	SPL	70075	RT
PBS 용액	Hyclone	SH30256.02	RT
1.5ml 튜브	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml 튜브	Hyundai Micro	H20015	RT
12 웰 플레이트	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell 기술	4230-20	C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT 분말)	Sigma	M5622	4 C °
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
strong>스페로이드 형성 분석에 필요한 재료
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	론자	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500-20	C°
페니실린-스트렙토마이신	Lonza	17-602E-20	C°
세포 배양 플라스크 T75	SPL	70075	RT
PBS 용액	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Corning costar 초저 부착물 96 웰 플레이트	Corning	3474	RT
현미경 Nikon		Eclipse TS100	RT
strong>제브라피쉬 이종이식에 필요한 재료
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	론자	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500-20	C°
페니실린-스트렙토마이신	Lonza	17-602E-20	C°
세포 배양 플라스크 T25	SPL	70025	RT
세포 배양 플라스크 T75	SPL	70075	RT
세포 배양 플라스크 T175	SPL	71175	RT
1.5ml 튜브	Extragene	Tube-170-C	RT
24 웰 플레이트	SPL	30024	RT
Petridish	SPL	10100	RT
PBS 솔루션	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
염화나트륨	: Sigma-Aldrich	71382	RT
염화칼륨 (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
황산 마그네슘 헵타 하이드레이트 (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
질산 칼슘 사수화물 (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES 용액	: Sigma-Aldrich	H0887	RT
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 (트리카인)	시그마-알드리치	E10521	RT
페놀 레드 용액	시그마-알드리치	P0290	RT
메틸셀룰로오스	시그마-알드리치	M0512	RT
1-페닐-2-티오우레아 (PTU)	시그마-알드리치	P7629	RT
CM-딜 염료	인비트로젠	C7001-20	C°
유리 모세관	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipette puller	셔터 기기, 미국	P-97	RT
Micro	injector World Precision Instruments	PV820	RT
주사기	KOVAX	1ml	RT
Micro loader	Eppendorf	5242956003	RT
Glass slide	Marienfeld	HSU-1000612	RT
형광 현미경	Leica	DE/DM 5000B	RT

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