Summary

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

Published: April 26, 2018
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Summary

Aqui usamos a eletroforese em gel de agarose semi desnaturação bidimensional para confirmar a presença de amiloide-como fibras de tamanho heterogêneo e excluir a possibilidade de que a heterogeneidade de tamanho é devido à dissociação das fibras de amiloides durante o gel processo em execução.

Abstract

Fibras de amiloides ou amiloide-como tem sido associadas com muitas doenças humanas e agora estão sendo descobertas importante para muitas vias de sinalização. A capacidade de detectar prontamente a formação destas fibras sob diferentes condições experimentais é essencial para a compreensão de sua função potencial. Muitos métodos têm sido utilizados para detectar as fibras, mas não sem alguns inconvenientes. Por exemplo, microscopia de elétron (EM), ou coloração com vermelho Congo ou Thioflavin T muitas vezes requer purificação das fibras. Por outro lado, eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação (SDD-idade) permite a detecção das fibras de amiloide como SDS-resistente em extratos de células sem purificação. Além disso, permite a comparação entre a diferença de tamanho das fibras. Mais importante, ele pode ser usado para identificar proteínas específicas dentro das fibras pela mancha ocidental. É menos demorado e mais facilmente acessível a um maior número de laboratórios. SDD-idade resultados muitas vezes mostram um grau variável de heterogeneidade. Levanta a questão se parte da heterogeneidade resulta da dissociação da proteína complexa durante a eletroforese na presença de SDS. Por esta razão, nós empregamos uma segunda dimensão de SDD-idade para determinar se a heterogeneidade de tamanho vista em SDD-idade verdadeiramente é um resultado de fibra heterogeneidade na vivo e não um resultado de degradação ou dissociação de algumas das proteínas durante eletroforese. Este método permite a confirmação rápida e qualitativa que as fibras de amiloide ou amiloide-como não são parcialmente dissociando durante o processo de SDD-idade.

Introduction

A formação de fibras amiloides devido ao enrolamento de proteínas tem sido conhecida para jogar um papel em condições patológicas como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e a doença de Huntington1. Mais recentemente, a formação de fibras amiloides ou amiloide-como foi mostrada para ser uma parte das vias de sinalização em humanos, incluindo durante anti-virais resposta imune inata2 e necroptosis3,4e em organismos inferiores como fermento5,6. Portanto, a capacidade de detectar essas fibras no laboratório é importante. Atualmente, existem três maneiras principais para detectar amiloide e fibras de amiloide, como: o uso de corantes e EM SDD-idade.

O uso de corantes, como o vermelho de Congo ou Thioflavin T, oferece a vantagem de ser rápida e facilmente detectável usando microscopia ou espectroscopia de7. No entanto, a detecção de pela microscopia, no caso de vermelho de Congo, não fornece nenhuma especificidade sobre quais proteínas compõem as fibras, ou o tamanho das fibras. Da mesma forma, o uso da espectroscopia para detectar a ligação vermelho Congo ou Thioflavin T de complexos de proteínas fornece somente um resultado positivo ou negativo.

EM fornece evidência conclusiva da presença de fibras e também informações quantitativas sobre a fibra comprimento e diâmetro8. No entanto, este método requer purificação muito rigorosa. Além disso, é uma técnica especializada que utiliza o equipamento caro.

SDD-idade tem sido usado para detectar SDS-resistente complexos de proteínas de Dalton mega incluindo amiloides ou amiloide-como fibras. Oferece muitas vantagens. Primeiro, ele não requer a purificação das fibras e é fácil de efetuar9. Em segundo lugar, fornece informações qualitativas sobre o tamanho das fibras, incluindo o tamanho relativo e a quantidade de heterogenicity de fibra. Por último, porque mancha ocidental pode ser realizada após eletroforese, é fácil detectar a presença de qualquer proteína para a qual existe um anticorpo, embora Note-se que porque SDD-idade é semi desnaturação, alguns resumos podem permanecer escondida que complica a deteção pelo anticorpo.

Recentemente, interação proteína quinase do receptor do 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) foram relatados à fibras de amiloides formulário para servir como plataformas de sinalização durante a necroptosis, uma forma programada de necrose3. Enquanto estudava estas fibras, nosso laboratório mostrou que outra proteína associada necroptosis, misturado a quinase de linhagem como domínio (MLKL), também formado de fibras de amiloide como4. No entanto, após um exame detalhado com SDD-idade, o tamanho das fibras MLKL apareceu distinto das fibras RIPK1 e RIPK3, que apareceu idênticas uns aos outros (Figura 1). Isso foi inesperado porque é sabido que MLKL vincula a RIPK1/RIPK3 para formar o necroptosis sinalização complexo chamado o necrosome10.

Existem pelo menos duas explicações. Primeiro, duas fibras de amiloide como totalmente distintas possam formar durante o necroptosis, um RIPK1 contendo/RIPK3 e o outro contendo MLKL. Em segundo lugar, apenas um tipo de amiloide-como fibras que contendo RIPK1/RIPK3/MLKL podem ser formado durante a necroptosis, mas a associação de MLKL com as outras proteínas é fraco suficiente que ele dissocia-se durante a idade do SDD.

Para resolver isso, propomos realizar uma bidimensional (2D) SDD-idade. SDD-idade-stable amiloide ou fibras de amiloide, como terá o mesmo padrão de migração durante a electroforese de primeira e segunda dimensão. Isto será detectável após a transferência das proteínas para uma membrana e realizar um Western blot. Fibras estáveis irão expor um padrão diagonal afiado. Qualquer desvio isto sugeriria que as fibras se submetem a mudanças devido a electroforese de SDS.

Protocol

1. preparar as amostras Amiloide de cultura 2×106 produzindo células de câncer de cólon HT-29 em um prato de cultura de tecido de 10 cm em 10 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina. Células de cultura durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2. Depois que as células crescem a confluência de 80%, lave as células com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 3 mL de solução de tripsi…

Representative Results

Após a indução de necroptosis, RIPK1 e RIPK3 mostraram quase idênticos padrões como amiloide (faixas 2 e 4, Figura 1). No entanto, fibras MLKL foram mais heterogêneas e pareciam ser menor do que fibras RIPK1/RIPK3 (faixa 6, Figura 1). Que nos levou a desenvolver o método de SDD-idade 2D para abordar a possibilidade MLKL formam fibras de RIPK1/RIPK3-independente ou MLKL dissocia-se simplesmente partir de fibras de RIPK1/RIP…

Discussion

O aspecto mais importante da 2D SDD-idade é que as condições de eletroforese são os mesmos para a primeira e segunda dimensão. A capacidade de detectar uma nítida linha diagonal a 45° (indicando que não há dissociação ou degradação ocorreu) depende das fibras migrando de forma idêntica durante os dois de electroforese. Usar diferentes condições, por exemplo, alterando a tensão ou o comprimento de tempo de execução, irá obscurecer estes resultados. Também, como é o caso de tradicional 1D SDD-idade, a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado por uma bolsa em S.H.-A. de NIH/NCATS (TL1TR001104), uma fundação de Welch conceder (I-1827), e uma concessão de R01 da NIGMS (RGM120502A) para Z.W. Z.W. é a Virginia Murchison Linthicum estudioso em pesquisas médicas e prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas estudioso (R1222).

Materials

gel electrophoresis unit Fisher HE99XPRO appratus for gel running.
agrose VWR 97062-250 For agarose gel.
paper tower Fisher 19-120-2484 for transfering
filter paper VWR 21427-386 for transfering
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177 for transfering
blocking milk powder Bio-Rad 1706404XTU for blocking in Western blot
MLKL antibody Genetex GTX107538 rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody BD Biosciences 610459 mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody gift from Dr. Xiaodong Wang rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP Sigma A6154 secondary antibody
ECL Fisher WBKLS0500 Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film Fisher F-BX810 for Western blot result
DMEM Sigma D6429 for cell culture
fetal bovine serum Sigma F4135 for cell culture
penicilin-streptomycin Sigma P4333 for cell culture
Trypsin solution Sigma T4049 for cell culture
PBS for tissue culture Sigma D8662 for cell culture
recombinant TNF made in our lab for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic gift from Dr. Xiaodong Wang for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK ApexBio A1902 for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter Bio-Rad 1450102 Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter Fisher 07-200-364 to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
10 mL glycerol
30 mL 5 M NaCl
840 mL ddH2O
10 mL Triton-X100
(protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L) 48.4 g Tris base
11.42 mL glacial acetic acid
20 mL 0.5M EDTA pH 8
ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) 5 mL 10X TAE
10 mL glycerol
4 mL 20% SDS
0.5 mL 10% bromophenol blue
31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
30 mL 5 M NaCl
950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L) 100 mL 10xPBS
800 mL ddH2O
1 mL Tween20
10X PBS (10 L) 800 g NaCl
20 g KCl
144 g Na2HPO4·2H2O
24 g KH2PO4
add ddH2O to 10 L

References

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
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  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
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  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

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Cite This Article
Hanna-Addams, S., Wang, Z. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers. J. Vis. Exp. (134), e57498, doi:10.3791/57498 (2018).

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