जीन लक्षित यादृच्छिक Mutagenesis का चयन करने के लिए Heterochromatin-स्थिर Proteasome म्यूटेंट विखंडन खमीर में
Summary
यह लेख विखंडन खमीर में एक लक्ष्य जीन के यादृच्छिक mutagenesis के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन है । एक उदाहरण के रूप में, हम लक्ष्य rpt4 +, जो 19S proteasome के एक उपइकाई सांकेतिक शब्दों में बदलना, और स्क्रीन उत्परिवर्तनों कि heterochromatin अस्थिर करने के लिए ।
Abstract
यादृच्छिक एक लक्ष्य जीन के mutagenesis सामांयतः उत्परिवर्तनों कि वांछित phenotype उपज की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तरीकों कि यादृच्छिक mutagenesis, त्रुटि प्रवण पीसीआर को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक विविध पूल म्यूटेंट (यानी, एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय) पैदा करने के लिए एक सुविधाजनक और कुशल रणनीति है । त्रुटि-प्रवण पीसीआर पसंद की विधि है जब एक शोधकर्ता एक पूर्व निर्धारित क्षेत्र, जैसे एक जीन की कोडिंग क्षेत्र के रूप में बदलना चाहता है, जबकि अंय जीनोमिक क्षेत्रों छोड़ने अप्रभावित । उत्परिवर्ती पुस्तकालय त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा परिलक्षित होता है के बाद, यह एक उपयुक्त प्लाज्मिड में क्लोन किया जाना चाहिए । त्रुटि प्रवण पीसीआर द्वारा उत्पन्न पुस्तकालय का आकार क्लोनिंग कदम की दक्षता से विवश है ।. हालांकि, विखंडन खमीर में, Schizosaccharomyces pombe, क्लोनिंग कदम एक अत्यधिक कुशल एक कदम फ्यूजन पीसीआर के उपयोग के लिए परिवर्तन के लिए निर्माण उत्पंन करने के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । वांछित phenotypes के म्यूटेंट उपयुक्त पत्रकारों का उपयोग कर चुने जा सकते हैं । यहां, हम विस्तार से इस रणनीति का वर्णन, एक उदाहरण के रूप में ले, एक संवाददाता centromeric heterochromatin में डाला ।
Introduction
आगे जेनेटिक्स एक शास्त्रीय विधि है जिसमें शोधकर्ताओं ने स्वाभाविक रूप से होने वाली म्यूटेंट की तलाश है कि एक विशेष phenotype प्रदर्शन, और आनुवंशिक विश्लेषण करते हैं । रिवर्स आनुवंशिकी में, उत्परिवर्तनों ब्याज की एक जीन में पेश कर रहे है और phenotype की जांच की है । उत्तरार्द्ध मामले में, एक लक्ष्य जीन के यादृच्छिक mutagenesis अक्सर म्यूटेंट के एक पूल है कि बाद में इस तरह के तापमान संवेदनशीलता या बदल एंजाइमी गतिविधि के रूप में वांछित phenotypes, के लिए चुना जाता है उत्पंन किया जाता है । यादृच्छिक mutagenesis प्राप्त करने के लिए विभिन्न विधियों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें त्रुटि-प्रवण पीसीआर1; यूवी विकिरण2; रासायनिक mutagens, जैसे एथिल methanesulfonate (ईएमएस) या नाइट्रस एसिड३; ऐसे उन पर व्यक्त mutD5 4के रूप में अस्थाई रूपांतरक उपभेदों, का उपयोग करें; और डीएनए फेरबदल5.
यहां, हम एक रिवर्स आनुवंशिकी रणनीति जिसमें हम त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग करने के लिए विखंडन खमीर में एक लक्ष्य जीन के लिए उत्परिवर्ती पूल उत्पंन का वर्णन । के रूप में एक अपने नाम से लगता है कि हो सकता है, इस विधि जानबूझकर पीसीआर के दौरान त्रुटियों को शुरू करने से उत्परिवर्तनों उत्पंन करता है । अन्य mutagenesis तरीकों के विपरीत, त्रुटि प्रवण पीसीआर उपयोगकर्ता mutagenized होने के लिए क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है । यह एक प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के प्रयासों में यह विशेष रूप से उपयोगी बनाता है/
इस यादृच्छिक mutagenesis प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए, हम इस के साथ साथ rpt4 +का उपयोग करें, जो 19S proteasome उपइकाई encodes एक उदाहरण के रूप में । Rpt4 विखंडन खमीर6,7,8,9, और प्रोटियोलिसिस में एक दोष के अलावा अंय जीवों में प्रोटियोलिसिस-स्वतंत्र कार्य किया है दिखाया गया है अप्रत्यक्ष प्रभाव में फेरबदल के कारण हो सकता है प्रोटीन स्तर. हम इसलिए, म्यूटेंट के लिए जांच की है कि प्रोटियोलिसिस-स्वतंत्र परिवर्तन ट्रिगर, heterochromatin पर proteasome के समारोह की छानबीन के लक्ष्य के साथ ।
त्रुटि प्रवण पीसीआर किसी भी जीन क्षेत्र में स्थान है जिस पर प्राइमरों बांध ट्यूनिंग द्वारा लागू किया जा सकता है । म्यूटेंट कि वांछित phenotypic परिवर्तन प्रदर्शन उचित पत्रकारों के साथ पहचाना जा सकता है । यहां, हम एक ade6 + centromere 1 बाहरी दोहराने (ओटीआर) क्षेत्र10में डाला रिपोर्टर का उपयोग किया । गठित heterochromatin इस क्षेत्र में11है, तो ade6 + रिपोर्टर जंगली प्रकार की हालत में मौन है का गठन किया है; यह लाल कालोनियों से संकेत मिलता है10. एक उत्परिवर्तन है कि centromere में गठित heterochromatin को अस्थिर ade6 + रिपोर्टर, जो सफेद कालोनियों के रूप में visualized है की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व करेंगे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
त्रुटि-प्रवण पीसीआर के माध्यम यादृच्छिक mutagenesis एक दिए गए क्षेत्र में म्यूटेंट के एक विविध पूल पैदा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । यह तकनीक विशेष रूप से अध्ययन के लिए उपयोगी है जो किसी विशिष्ट परिस्थ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के लिए फंडिंग सहायता को बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित विज्ञान एवं आईसीटी (2016R1A2B2006354) के माध्यम से प्रदान किया गया ।
Materials
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
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